瓜炭疽病菌的荧光PCR检测方法及所用引物和探针技术

本发明专利技术公开了用于瓜炭疽病菌的荧光PCR检测方法的引物和探针，为以下两种：一、GAPDH基因：5’-CCCTTCATTGAGACCAAGT-3’，5’-GTACTTGAGCATGTAGGCCT-3’；5’FAM-CCGGGATCTCTGGCATTACG-3’TAMRA；二、GS基因：5’-TTCGTTCTCGAACACGAT-3’，5’-GAGACATGACGACCTTGTTC-3’；5’FAM-TGCACGTCTGGTCCAGTTCTGT-3’TAMRA。本发明专利技术还同时提供了利用上述引物和探针进行的瓜炭疽病菌的荧光PCR检测方法，当2种PCR均能检测到荧光时，判定为阳性。

【技术实现步骤摘要】
瓜炭疽病菌的荧光PCR检测方法及所用引物和探针
本专利技术涉及瓜炭疽病菌的荧光PCR检测方法及所用引物和探针。
技术介绍
瓜类炭疽病是瓜类作物生产中的重要病害之一，全国各地均有分布。发病时常造成幼苗猝倒，成株茎、叶枯死，瓜果腐烂，危害严重。西瓜和甜瓜易感病，黄瓜、冬瓜、瓠瓜、苦瓜次之，南瓜、西葫芦，丝瓜较抗病。瓜炭疽病菌长距离传播主要依靠感病的植株、病残体以及受侵染的种子等植物性材料。目前国内未见报道有关检测该病菌的荧光PCR特异性引物和探针。目前瓜炭疽病菌的检验方法主要是常规种子带菌检验。这种方法经验性较强，瓜炭疽病菌和其他近似病原菌在形态上较难区分。因此建立对瓜炭疽病菌快速、准确的检测方法至关重要。本专利技术所设计参考文献具体如下：[1]李怀方，刘凤权，黄丽丽主编.园艺植物病理学[M].中国农业大学出版社2011，172[2]唐建辉，王伟.西瓜炭疽菌核糖体基因ITS区段的克隆及序列分析[J].安徽农业科学.2007，35(9):2566-2568,2658.[3]尹玉琦，李国英主编.新疆农作物病害.[M]新疆科技卫生出版社1995，185[4]唐建辉，王伟，王源超.西瓜炭疽病菌Colletotrichumorbiculare的分子检测[J].中国农业科学.2006，39(10):2028-2035[5]赵杰.ITS序列分析及其在植物真菌病害分子检测中的应用[J].陕西农业科学.2004(4):35-37.[6]葛建军,曹爱新,陈洪俊,MariceMoens.应用TaqMan探针进行马铃薯金线虫实时荧光PCR检测技术研究[J].植物保护.2009,35(4):105-109.[7]伍永明,张祥林,罗明.西瓜细菌性果斑病菌TaqMan探针实时荧光PCR检测鉴定方法的建立[J].新疆农业大学学报.2006,29(3):68-72.[8]纪冬,辛绍杰.实时荧光定量PCR的发展和数据分析[J].生物技术通讯.2009,(4):598-600.[9]赵焕英,包金风.实时荧光定量PCR技术的原理及其应用研究进展[J].中国组织化学与细胞化学杂志.2007,16(4):292-497.[10]纪冬,辛绍杰.实时荧光定量PCR的发展和数据分析[J].生物技术通讯.2009,(4):598-600.[11]赵焕英,包金风.实时荧光定量PCR技术的原理及其应用研究进展[J].中国组织化学与细胞化学杂志.2007,16(4):292-497.[11]林剑伟，阙友雄，陈天生，等.核糖体DNA的内转录间隔区序列标记在真菌分类鉴定中的应用[J].生物技术通讯.2007，18(2):292-294.[12]段维军,郭立新.基于PCR技术的植物病原真菌检测技术研究进展[J].植物检疫.2008,22(6):385-389.
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种瓜炭疽病菌的荧光PCR检测方法及所用引物和探针；该方法具有特异性、稳定性和灵敏性都非常好的特点。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种瓜炭疽病菌的荧光PCR检测方法及所用引物和探针；从GenBank查询所有瓜炭疽病菌的GAPDH基因和GS基因相关序列，设计瓜炭疽病的特异性引物和TaqMan探针。具体为如下两种：一、针对GAPDH基因：引物：GAPDH-3：5’-CCCTTCATTGAGACCAAGT-3’GAPDH-4：5’-GTACTTGAGCATGTAGGCCT-3’；TaqMan探针：GAPDH-p：5’FAM-CCGGGATCTCTGGCATTACG-3’TAMRA；产物大小234bp；二、针对GS基因：引物：GS-3：5’-TTCGTTCTCGAACACGAT-3’GS-4：5’-GAGACATGACGACCTTGTTC-3’；TaqMan探针：GS-p：5’FAM-TGCACGTCTGGTCCAGTTCTGT-3’TAMRA。产物大小209bp。本专利技术还同时提供了利用上述特异性引物和TaqMan探针进行的瓜炭疽病菌的荧光PCR检测方法：包括以下步骤：1)、提取待测植物材料(包括种子等)的DNA；2)、PCR：一、GAPDH基因：25μL反应体系：10×Buffer2.5μL，25mmol/LMg2+3.5μl，2.5mmol/LdNTP0.5μL，5U/μLTaqMan聚合酶0.2μL，上下游引物(10μmol/L)各0.5μL，TaqMan探针(10μmol/L)0.5μL，模板DNA:0.5-2μL，最终用三蒸水补足至25μL；反应程序为：95℃3min；(95℃15s，57.9℃1min，40个循环)；反应中止；二、GS基因：25μL反应体系：10×Buffer2.5μL，25mmol/LMg2+3μl，2.5mmol/LdNTP0.5μL，5U/μLTaqMan聚合酶0.2μL，上下游引物(10μmol/L)各0.5μL，TaqMan探针(10μmol/L)0.5μL，模板DNA:0.5-2μL，最终用三蒸水补足至25μL；反应程序为：95℃3min；(95℃15s，56℃1min，40个循环)；反应中止；备注说明：Mg2+具体为MgCl2；3)、当步骤2)的2种PCR均能检测到荧光(Ct值小于40)时，判定为阳性，否则判定为阴性。备注说明：本专利技术使用的荧光PCR仪中温度梯度所用PCR为Eppendorf荧光PCR仪。确定退火温度后所用的荧光PCR仪为ABI公司7300。rDNA-ITS是介于18SrDNA、5.8SrDNA、28SrRNA之间的区域，该区域进化速度较编码区快，被普遍用来进行真菌种间或种内的遗传相似性的分子系统研究。但是在瓜炭疽病菌的序列比对中该区段很难找到突变位点设计探针，本专利技术选择瓜炭疽病菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因和glutaminesynthase(GS)基因序列设计引物探针，通过对瓜上其他病害和瓜炭疽病菌的检测研究，结果表明该方法具有良好的特异性、稳定性和灵敏性。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。图1为GAPDH引物和探针不同退火温度Tm值对实时荧光PCR检测体系的影响(Fig1、TheinfluenceofdifferenttemperaturemeltontheReal-TimePCRsystemusingGAPDHprimersandprobe)；1：55.2℃；2：55.4℃；3：56℃；4：56.8℃；5：57.9℃；6：59.1℃；7：60.4℃；8：61.4℃；9：62.6℃；10：63.5℃；11：64℃；12：64.1℃；13：空白对照。图2为GS引物和探针不同退火温度Tm值对的实时荧光PCR检测体系的影响(Fig2、TheinfluenceofdifferenttemperaturemeltontheReal-TimePCRsystemusingGSprimersandprobe)；1：55.2℃；2：55.4℃；3：56℃；4：56.8℃；5：57.9℃；6：59.1℃；7：60.4℃；8：61.4℃；9：62.6℃；10：63.5℃；11：64℃；12：64.1℃；13：空白对照。图3为GAPDH引物和探针不同Mg2+浓度对实时荧光PCR检测体系的影响(Fi本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于瓜炭疽病菌的荧光PCR检测方法的引物和探针，其特征是：为以下两种：一、GAPDH基因：引物：GAPDH‑3：5’‑CCCTTCATTGAGACCAAGT‑3’GAPDH‑4：5’‑GTACTTGAGCATGTAGGCCT‑3’；TaqMan探针：GAPDH‑p：5’FAM‑CCGGGATCTCTGGCATTACG‑3’TAMRA；二、GS基因：引物：GS‑3：5’‑TTCGTTCTCGAACACGAT‑3’GS‑4：5’‑GAGACATGACGACCTTGTTC‑3’；TaqMan探针：GS‑p：5’FAM‑TGCACGTCTGGTCCAGTTCTGT‑3’TAMRA。

【技术特征摘要】
1.用于瓜炭疽病菌的荧光PCR检测方法的引物和探针，其特征是：为以下两种：一、GAPDH基因：引物：GAPDH-3：5’-CCCTTCATTGAGACCAAGT-3’GAPDH-4：5’-GTACTTGAGCATGTAGGCCT-3’；TaqMan探针：GAPDH-p：5’FAM-CCGGGATCTCTGGCATTACG-3’TAMRA；二、GS基因：引物：GS-3：5’-TTCGTTCTCGAACACGAT-3’GS-4：5’-GAGACATGACGACCTTGTTC-3’；TaqMan探针：GS-p：5’FAM-TGCACGTCTGGTCCAGTTCTGT-3’TAMRA。2.利用根据权利要求1所述的引物和探针进行的瓜炭疽病菌的荧光PCR检测方法，其特征是包括以下步骤：1)、提取待测植物材料的DNA；2)、PCR：一、GAPDH基因：25μL反应体系：10×Buffer2.5μL，25m...

【专利技术属性】
技术研发人员：王翀，雷勇辉，孙燕飞，朱建军，张小菊，李亚伟，张祥林，张伟，
申请(专利权)人：新疆出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：新疆;65