一种热带植物多糖多酚小RNA提取方法技术

本发明专利技术公开了一种热带植物多糖多酚小RNA提取方法，该热带植物多糖多酚小RNA提取方法包括以下步骤：采样热带植物叶片，冻入液氮，-80℃保存；准备小RNA提取的试剂，CTAB裂解缓冲液、PEG8000沉淀缓冲液、EDC交联缓冲液、miRNA?Northern?blotting杂交缓冲液、7%dPAGE、Washing?Buffer；按照小RNA提取的预处理、Trizol抽提、分级沉淀高分子量RNA、沉淀小RNA，提取小RNA；按照17%dPAGE分离、转膜及交联、miRNA杂交及洗膜、小RNA杂交及洗膜、曝光及保存，实现RNA杂交；miRNA?stem-loop?RT-PCR扩增；开展多糖多酚植物小RNA的提取以及检测分析。本发明专利技术克服了目前植物小RNA提取方法的不足，具有快速、稳定、操作简便的特点，可以针对miRNA和siRNA进行快速提取和检测分析，具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种热带植物多糖多酚小RNA提取方法
本专利技术属于RNA提取
，尤其涉及一种热带植物多糖多酚小RNA提取方法。
技术介绍
植物小RNA是一种负调控因子，根据序列的特异性在转录和转录后水平调控基因表达、DNA和组蛋白甲基化以及抵抗外源遗传因子，如病毒、转座子或转基因的入侵。依据小RNA的生物合成特点，植物小RNA主要分为两类：植物小干扰RNA（siRNA，small/shortinterferingRNA)和微RNA（miRNA，miRNA)。二者长度约为20～25nt，均由类似RNAeIII的核酸内切酶Dicer（或Dicer类似蛋白）加工产生，它们的形成既有联系又有区别。微RNA（或miRNA）是一种长度介于20-24nt的单链小分子RNA，由Ⅲ型RNAeDicer从含有茎环结构的内源转录本中切割产生。siRNA途径是由dsRNA引发的，而miRNA途径由内源性hpRNA诱导。siRNA和miRNA都由DCL（或Dicer类似蛋白）剪切形成，其中与mRNA互补的链结合RNA诱导的沉默复合体。miRNA基因广泛分布于植物基因组中，在基因组上通常具有独立的基因座位(1ocus)，转录产物自身折叠成不完全配对的发卡结构(hairpin)。miRNA与靶基因绝大多数情况下以不完全互补的方式起作用。小干扰RNA（siRNA）来自长的完全互补的双链RNA，如病毒RNA，反向重复序列或由依赖于RNA的RNA聚合酶（RNAdependentRNApolymerase,RdRp）合成的dsRNA。在拟南芥中siRNA还可以分成反式作用siRNA（trans-actingsiRNA，tasiRNA）、内源顺反转录本siRNA（naturalcis-antisensesiRNA,nat-siRNA）、异染色质siRNA（HeterochomaticsiRNA，hcsiRNA），它们的RNA沉默途径各异。其中反式作用siRNA研究比较清楚，tasiRNA是由内源TAS转录本产生，其生物发生途径将miRNA和siRNA生物途径有机融合，产生级联tasiRNA，其中tasiR-ARF3和tasiR-ARF4是两个保守的siRNA序列，参与拟南芥叶片的极性发育，在玉米中raggedseedling2编码AGO7-like蛋白，产生的ta-siARFs参与玉米极性发育。获得高质量的小RNA是后续研究其表达和功能的前提条件。目前，模式植物的小RNA提取方法已经非常成熟，采用Trizol或者miRNAkit可以获得很好的结果。然而，对于热带植物而言，体内含有多糖多酚，一般的裂解液既不能去除多糖也不能去除多酚，所以无法很好的提取多糖多酚植物的小RNA，阻碍了其分子生物学方面研究的进展。在RNA提取过程中，细胞破碎后多糖多酚物质与RNA发生作用。酚类化合物被氧化后会与RNA不可逆地结合，导致RNA活性丧失及在用苯酚、氯仿抽提时RNA的丢失，或形成不溶性复合物；而多糖会形成难溶的胶状物，与RNA共沉淀下来；萜类化合物和RNase会分别造成RNA的化学降解和酶解。因此，摸索一种适合多糖多酚植物的小RNA提取方法对于后续的研究至关重要。Trizol是植物中应用最广泛、最简便的商业化总RNA提取方法，开发Trizol作为植物小RNA提取方法是最简便和适用的技术。但是，热带植物含有高浓度的多糖多酚，还有单宁以及其他次生物质。在植物材料匀浆时，多酚物质氧化成醌类物质后与RNA稳定地结合；多糖理化性质与RNA很相似，因此很难将它们分开，沉淀后与RNA一起产生凝胶状沉淀。而Trizol主要成份是异硫氰酸胍和苯酚，即使添加了如2-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）或半胱氨酸之类的防止酚氧化的试剂也很难提取。因此，在前期样品处理的时候去除这些杂质是后续提取高质量小RNA的关键。目前，关于植物小RNA提取方法已有报道。Songetal.(2010)利用Trizol和LiCl分级沉淀分离柑桔小RNA（Songetal.,2010）；Chengetal.(2010）采用低盐CTAB缓冲液提取拟南芥的小RNA（Chengetal.,2010）；还有多糖植物的CTAB方法（Carraetal.,2007;2009）等都是先分离总RNA，然后再利用LiCl或者PEG8000沉淀大分子RNA，再将上清中的小RNA沉淀从而获得高质量的小RNA。deFátimaetal.(2011)报道利用LiCl缓冲液和PEG8000不仅可以从拟南芥等模式植物，还可以从仙人掌、龙舌兰以及香蕉等植物中提取高质量的小RNA用于northernblotting分析（deFátimaetal.,2011）。目前，Songetal.(2010)、Carraetal.,（2007;2009）、Chengetal.(2010）等建立的小RNA提取方法主要针对一些模式植物，而对于多糖多酚的植物小RNA提取方法，只有deFátimaetal.,（2011）有相关的研究。但是deFátimaetal.,（2011）采用LiCl缓冲液提取总RNA，结合LiCl沉淀分离小RNA，并没有将植物中的多糖多酚有效去除，导致提取的小RNA由于结合不同的杂质，在PAGE电泳过程中出现弥散的电泳谱带，杂交后出现两条杂交条带，这给后续小RNA的检测以及功能分析带来相当的难度。因此，改良小RNA提取方法，有效去除植物中的多糖多酚杂质防止其与小RNA结合而出现迁移率的变化，快速提取高质量的miRNA和siRNA并进行后续小RNAnorthernblotting和Stem-loopRT-PCR检测分析是目前急迫需要解决的问题。
技术实现思路
本专利技术实施例的目的在于提供一种热带植物多糖多酚小RNA提取方法，旨在解决去除植物中的多糖多酚杂质与小RNA结合而出现迁移率的变化的问题。本专利技术实施例是这样实现的，本专利技术实施例的热带植物多糖多酚小RNA提取方法，该热带植物多糖多酚小RNA提取方法包括以下步骤：步骤一、采样热带植物叶片，冻入液氮，-80℃保存；步骤二、准备小RNA提取的试剂，CTAB裂解缓冲液、PEG8000沉淀缓冲液、EDC交联缓冲液、miRNANorthernblotting杂交缓冲液、7%dPAGE、WashingBuffer；步骤三、按照小RNA提取的预处理、Trizol抽提、分级沉淀高分子量RNA、沉淀小RNA，提取小RNA；步骤四、按照17%dPAGE分离、转膜及交联、miRNA杂交及洗膜、小RNA杂交及洗膜、曝光及保存，实现RNA杂交；步骤五、miRNAstem-loopRT-PCR扩增；步骤六、开展多糖多酚植物小RNA的提取以及检测分析。进一步，在步骤二中，提取小RNA的试剂如下：CTAB裂解缓冲液：4M异硫氰酸胍，2%w/vCTAB，100mMTris-HCLpH8.5，25mMEDTA，2MNaCl，2%w/vPVP-40，and2%v/v2-巯基乙醇；PEG8000沉淀缓冲液：20%w/vPEG8000，1MNaCl；EDC交联缓冲液12ml：122.5μl12.5M1-甲基咪唑pH8.0，0.373g1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐；miRNANorthernblotting杂交本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种热带植物多糖多酚小RNA提取方法，其特征在于，该热带植物多糖多酚小RNA提取方法包括以下步骤：步骤一、采样热带植物叶片，冻入液氮，?80℃保存；步骤二、准备小RNA提取的试剂，CTAB裂解缓冲液、PEG8000沉淀缓冲液、EDC交联缓冲液、miRNANorthernblotting杂交缓冲液、7%dPAGE、WashingBuffer；步骤三、按照小RNA提取的预处理、Trizol抽提、分级沉淀高分子量RNA、沉淀小RNA，提取小RNA；步骤四、按照17%dPAGE分离、转膜及交联、miRNA杂交及洗膜、小RNA杂交及洗膜、曝光及保存，实现RNA杂交；步骤五、miRNAstem?loopRT?PCR扩增；步骤六、开展多糖多酚植物小RNA的提取以及检测分析。

【技术特征摘要】
1.一种提取多糖多酚热带植物中小RNA的方法，其特征在于，该提取多糖多酚热带植物中小RNA的方法包括以下步骤：步骤一、采样热带植物叶片，冻入液氮，-80℃保存；步骤二、准备小RNA提取的试剂，CTAB裂解缓冲液、PEG8000沉淀缓冲液、EDC交联缓冲液、miRNANorthernblotting杂交缓冲液、7％dPAGE、WashingBuffer；步骤三、按照小RNA提取的预处理、Trizol抽提、分级沉淀高分子量RNA、沉淀小RNA，提取小RNA；步骤四、按照17％dPAGE分离、转膜及交联、miRNA杂交及洗膜、小RNA杂交及洗膜、曝光及保存，实现RNA杂交；步骤五、miRNAstem-loopRT-PCR扩增；步骤六、开展多糖多酚植物小RNA的提取以及检测分析；在步骤二中，提取小RNA的试剂如下：CTAB裂解缓冲液：4M异硫氰酸胍，2％w/vCTAB，100mMTris-HCLpH8.5，25mMEDTA，2MNaCl，2％w/vPVP-40，and2％v/v2-巯基乙醇；PEG8000沉淀缓冲液：20％w/vPEG8000，1MNaCl；EDC交联缓冲液12ml：122.5μl12.5M1-甲基咪唑pH8.0，0.373g1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐；miRNANorthernblotting杂交缓冲液：5×SSC，20mMNaHPO4pH7.2，7％SDS，3×Denhardt`s溶液；17％dPAGE：尿素12.6g，水1.25ml，10×TBE1.5ml，Acr/Bis30％17ml，在微波炉中溶解尿素，待冷却后加入240μl10％AP，混匀后再加入10μlTEMED；WashingBuffer：2×SSC，0.1％SDS；在步骤三中，小RNA提取的具体方法如下：第一步，预处理：取2g～3g叶片液氮研磨后将粉末转入DEPC处理过的50ml的离心管中，加入20ml的CTAB裂解缓冲液，涡旋不少于30s后将裂解产物放在室温3分钟～5分钟，然后12000g4℃离心5min；第二步，Trizol抽提：离心后的上清转入一干净的50-ml离心管，加入等体积的Trizol试剂，充分涡...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭军，张贺，蒲金基，张欣，谢艺贤，漆艳香，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：