一种快速高效的水稻原生质体制备和转化方法技术

本发明专利技术公开了一种快速高效的水稻原生质体制备和转化方法，在拟南芥原生质体制备和转化的基础之上，对水稻原生质体的制备和转化方法进行改良优化。以水稻幼茎为起始材料，采用纤维素酶R-10和果胶酶R-10，对水稻组织进行消化并利用蔗糖密度梯度自沉降的方法分离原生质体，可获得高纯度的原生质体。对质粒转化原生质体时的转化方法、反应时间及质粒浓度进行探索，在缩短原生质体分离时间的同时，大大提高了转化效率。用较微量的质粒DNA即可获得外源基因在原生质体内高效的表达，且转化效率可达70%以上。本发明专利技术有益的效果：它能够克服采用离心法分离原生质体造成细胞碎片等杂质含量高的缺陷；明确茎、叶原生质体的形态差异；得到高纯度的原生质体；增进转化效率。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，在拟南芥原生质体制备和转化的基础之上，对水稻原生质体的制备和转化方法进行改良优化。以水稻幼茎为起始材料，采用纤维素酶R-10和果胶酶R-10，对水稻组织进行消化并利用蔗糖密度梯度自沉降的方法分离原生质体，可获得高纯度的原生质体。对质粒转化原生质体时的转化方法、反应时间及质粒浓度进行探索，在缩短原生质体分离时间的同时，大大提高了转化效率。用较微量的质粒DNA即可获得外源基因在原生质体内高效的表达，且转化效率可达70%以上。本专利技术有益的效果：它能够克服采用离心法分离原生质体造成细胞碎片等杂质含量高的缺陷；明确茎、叶原生质体的形态差异；得到高纯度的原生质体；增进转化效率。【专利说明】
本专利技术涉及涉及水稻原生质体的分离的新方法以及质粒转化原生质体的相关应用，主要是。
技术介绍
原生质体瞬时表达是细胞功能学研究的重要操作手段。近年来，双子叶植物拟南芥原的生质体被广泛用于胞内运输机制的探索、蛋白的亚细胞定位、蛋白-蛋白互作、DNA与蛋白质的相互反应等许多领域。单子叶植物水稻的原生质体的相关报道也越来越多。但由于研究起步较晚，在原生质体分离和转化的方法上还有很多可以改进的地方。在过去很长一段时间内，单子叶植物原生质体是借助植物组织培养技术建立的悬浮细胞培养体系分离而来的，这种方法所需周期较长，且培养过程中容易染菌，并不能做到瞬时、快捷。研究发现，以水稻幼茎，叶和叶鞘等组织为试验材料，也可以分离出优质的原生质体。但幼茎、叶及叶鞘的原生质体形态上还有一定的差别，这些差别并没有完全证实。此外，不管是在拟南芥、水稻还是其他植物的原生质体分离过程中，在获取原生质体的过程中都采用离心的方法收集，容易混有大量的细胞碎片，会干扰后续过程中的转化效率及其他酶促反应。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供，它能够克服采用离心法分离原生质体造成细胞碎片等杂质含量高的缺陷；明确茎、叶原生质体的形态差异；得到高纯度的原生质体；增进转化效率。本专利技术的目的是通过如下技术方案来完成的。这种快速高效的水稻原生质体制备和转化方法，主要是根据密度梯度自沉降的方法可以不使用离心而使大小均一的细胞在合适的浓度梯度上沉淀，以及原生质体自身可以摄取外源大分子物质的原理，酶解水稻幼茎细胞壁获得的原生质体和建立高效的瞬时表达体系，该方法包括如下步骤:( I)水稻种子去颖壳，消毒；(2)消毒种子在1/2MS培养基上培养10-15天，待其长成15_20cm高的幼苗；培养条件:25°C，光照12h，黑暗12h，光照强度:8000Lux ；(3)取水稻幼茎，剥去叶鞘，切成0.5mm大小片段，然后加入渗透剂，暗条件放置20-30分钟；所述渗透剂为0.3mol/L山梨醇和50mM氯化钙的混合液TVL ；(4)加入酶解液酶解细胞壁以获得原生质体；具体方法如下:在室温22_25°C条件下，将酶解液加入的水稻幼茎和渗透剂的混合液中，真空抽滤Ih ;然后置于水平摇床上60r/min 摇 4h ；(5)用25um的尼龙网膜过滤酶解后的混合物，弃滤渣；滤液上层缓慢滴加等渗的W5溶液，4°C滤液静置30min以上，待溶液分层；(6)吸取中层IOml的原生质体，用10mlW5溶液洗涤(100g离心5-10min，弃上清)，2-3次，即获得较为纯净的原生质体；(7)原生质体转化:以终浓度为20%的PEG为媒介，将带有35S驱动的增强型绿色荧光蛋白EGFP的质粒pSTANl转化进入原生质体:转化体系如下:10ul质粒，IOOul原生质体用MMG溶解，11Ou140%的PEG-Cacl2 ;室温放置5_15min，然后加入W5溶液至反应体系的总体积为Iml以终止反应；100g离心5min，去上清；再加入Iml W5悬浮原生质体，于25°C黑暗条件下培养2-24小时。所述的消毒方法如下:体积百分比为70%酒精洗30s ;蒸馏水洗一次；体积百分比为50%NaC10摇洗30min ;灭菌蒸懼水洗8_10次。所述的酶解液为3%纤维素酶R-1O和0.6%果胶酶R_10、1M蔗糖、pH5.7的0.2MMESUM 二水氯化钙、2M氯化镁配制成的混合液，55°C温育lOmin，使蛋白酶失活，冷却后过滤除菌。转化时，原生质体需预先在冰上放置30min，然后加入MMG溶液悬浮，MMG由4mMMESρΗ5.7，0.4Μ Mannitol, 15mM MgCl2 组成，转化采用的媒介为 PEG，由 40%PEG4000，0.2MMannitol, IOOmM CaCl2 组成。本专利技术的有益效果是:使用本方法简单快速，应用真空抽滤，使细胞产生轻微的质壁分离，加速渗透剂和酶液的渗透，能大大提高酶解效率。在短时期的酶解后，就能获得大量游离细胞。采用密度梯度自沉降法可从水稻的幼茎中分离到高纯度的原生质体细胞，细胞内的叶绿体含量少，大小较为一致，在较高倍的物镜下可清晰的辨别细胞器的结构为后续的转化和其它分子生物学操作提供方便。并通过改变后续转化时的质粒浓度，转化时间和转化条件等参数，建立起一个快速、简便并高效的水稻原生质体瞬时表达系统，为今后水稻基因功能组学研究搭建了一个可 靠的技术平台。【专利附图】【附图说明】图1是采用离心法和密度梯度自沉降法获得的原生质体对比图图2是离心和自沉降所获原生质体二乙酸荧光素染色对比图(12x)图3是不同浓度质粒转染原生质体的活力对比图1图4是不同浓度质粒转染原生质体的活力对比图2 ；图5是不同转化条件下所得原生质体活力对比图。【具体实施方式】下面通过【具体实施方式】对本专利技术作进一步阐述，实施例将帮助更好地理解本专利技术，但本专利技术并不仅仅局限于下述实施例。实施例中，使用的溶液组成如下:TVL 溶液:0.3mol/LSorbitol,50mM CaCl20W5 溶液:154mM NaCl, 125mM CaCl2.2H20, 5mM KCl,2mM MES (pH5.7)。酶解液:1MSurcose,0.2M MES (pH5.7), IM CaCl2.2H20, 2M KCL, 3%Cellulase,0.6%Mecerozyme ;酶解液先在55?水浴中温育lOmin,除蛋白酶,然后用滤膜过滤除菌。MMG 溶液:4mM MES (ρΗ5.7),0.4M Mannitol, 15mM MgCl20PEG 转化液:40%PEG4000，0.2M Mannitol, IOOmM CaCl201/2MS培养基:每升水中含1.1g MS, 0.125g MES, IOg蔗糖以及4g植物凝胶，调pH至5.7。水稻原生质体的分离I)取适量颗粒饱满的日本晴种子去颖壳，装入50ml无菌离心管，70%的乙醇洗30s ;无菌水清洗一次；加入足量50%的次氯酸钠,置水平摇床消毒30min后在超净台用灭菌蒸馏水洗8-10次。2)种子在1/2MS培养基上培养至12天龄。培养条件:温度25°C，光照12h，黑暗12h，光强:8000Luxo3)在超净台上用锋利的手术刀片将植物组织切成0.5mm大小条段，转入装有15mlTVL溶液的小烧杯中静置20-30分钟。4)加入酶液15ml，摇匀，抽真空Ih ；5)置于水平摇床上，25°C黑暗条件下，60rpm，摇4h。6本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速高效的水稻原生质体制备和转化方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：（1）水稻种子去颖壳，消毒；（2）消毒种子在1/2MS培养基上培养10?15天，待其长成15?20cm高的幼苗；培养条件：25℃，光照12h，黑暗12h，光照强度：8000Lux；（3）取水稻幼茎，剥去叶鞘，切成0.5mm大小片段，然后加入渗透剂，暗条件放置20?30分钟；所述渗透剂为0.3mol/L山梨醇和50mM氯化钙的混合液TVL；（4）加入酶解液酶解细胞壁以获得原生质体；具体方法如下：在室温22?25℃条件下，将酶解液加入的水稻幼茎和渗透剂的混合液中，真空抽滤1h；然后置于水平摇床上60r/min摇4h；（5）用25um的尼龙网膜过滤酶解后的混合物，弃滤渣；滤液上层缓慢滴加等渗的W5溶液，4℃滤液静置30min以上，待溶液分层；（6）吸取中层10ml的原生质体，用10mlW5溶液洗涤，100g离心5?10min，弃上清，2?3次，即获得较为纯净的原生质体；（7）原生质体转化：以终浓度为20%的PEG为媒介，将带有35S驱动的增强型绿色荧光蛋白EGFP的质粒pSTAN1转化进入原生质体：转化体系如下：10ul质粒，100ul原生质体用MMG溶解，110ul40%的PEG?Cacl2；室温放置5?15min，然后加入W5溶液至反应体系的总体积为1ml以终止反应；100g离心5min，去上清；再加入1ml?W5悬浮原生质体，于25℃黑暗条件下培养2?24小时。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱英，段炼，徐恒，钱君，郭小雨，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：