本发明专利技术提供核酸，该核酸从5’侧往3’侧依次包含：丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的5’非翻译区；包含NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列和NS5B蛋白编码序列的病毒蛋白编码区；以及3’非翻译区，而且，以J6CF株的前体蛋白的氨基酸序列为基准时，上述NS4A蛋白编码序列具有第1680位的丙氨酸取代成谷氨酸的突变。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】来自丙型肝炎病毒J6CF株基因组的突变体复制子
本专利技术涉及来自丙型肝炎病毒J6CF株基因组的突变体复制子。
技术介绍
已知丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus;以下记作HCV)是属于黄病毒科的、以单链(+)链有义RNA作为基因组的病毒，其成为丙型肝炎的病因。根据近年的研究，得知HCV根据其基因型或血清型分为多个类型。根据Simmonds等人的使用HCV株的核苷酸序列的系统分析法，将HCV的基因型分为6个类型，并进一步将它们分为若干个亚型(非专利文献I)。目前，关于HCV的多个基因型，正在确定基因组全长的核苷酸序列(非专利文献2~6)。到近年为止，都无法使HCV感染培养细胞、或者无法使HCV基因组在培养细胞中复制，因此为了对HCV的复制机制或感染机制进行研究，需要使用黑猩猩作为实验动物来进行体内实验。但是，通过由作为基因型Ib的HCV的ConI株、HCV-N株和HCV-O株、以及作为基因型Ia的HCV的H77株制作了亚基因组复制子RNA，关于HCV的复制机制的研究，可以使用培养细胞进行体外实验(专利文献I和非专利文献7~10)。这里，HCV的亚基因组复制子RNA是指，包含HCV的复制所必需的基因组部分，并且当导入到培养细胞中时可以自主复制来自HCV基因组的RNA，但不具有感染性HCV颗粒的产生能力的RNA。而且，由作为基因型2a的HCV的JFH-1株制作了亚基因组复制子RNA、以及通过在体外导入到Huh7细胞中而产生感染性HCV颗粒的全基因组复制子RNA，关于HCV的感染机制的研究，也可以使用培养细胞进行体外实验(非专利文献11和12)。这里，HCV的全基因组复制子RNA是指，包含HCV基因组的全长、即5’非翻译区、结构基因、非结构基因和3’非翻译区的RNA，是导入到培养细胞中时可以自主复制来自HCV基因组的RNA的RNA。J6CF株是与JFH-1株相同的基因型2a的HCV。关于J6CF株和JFH-1株的同源性，在核酸水平高达约90%，在氨基酸水平高达91%。但是，J6CF株缺少作为亚基因组复制子RNA的复制能力，而且也不具有在使用Huh7细胞的培养细胞系统中产生病毒颗粒的能力。近年来，研究显示:若将J6CF株的基因组的NS3蛋白编码区、NS5B蛋白编码区和3’非翻译区取代成JFH-1株的相同区的序列，则J6CF株可以在Huh7细胞中进行自主复制(非专利文献13)。另外，研究显示:将J6CF株的基因组的NS3蛋白编码区和3’非翻译区取代成JFH-1株的相同区的序列、并且导入NS5B蛋白编码区内的3个适应性突变而制作的亚基因组复制子RNA和全基因组复制子RNA具有自主复制能力和产生病毒颗粒的能力(非专利文献14)。在HCV的研究和抗HCV药的研究开发中，可以高效率地扩增病毒的实验系统是必不可少的。而且，如果有使HCV在培养细胞中扩增的系统、或者在培养细胞中评价HCV的增殖的系统，则不仅可以有效率`地筛选抗HCV药，还可以理解病毒增殖的细节，可以明确抗HCV药的新的靶，由此可以期待着研发出针对所发现的靶的革新的抗HCV药。关于J6CF株，也期待着制作可以在培养细胞内进行自主复制或产生病毒颗粒的复制子RNA。但是，以往认为具有产生感染性HCV颗粒的能力的全基因组复制子RNA必需包含来自JFH-1株的序列作为病毒的复制所必需的非结构基因。迄今为止得到的在培养细胞系统中进行自主复制、并且产生HCV颗粒的来自J6CF株的全基因组复制子RNA也只是由将J6CF株基因组中的非结构基因的相当多的部分取代成来自JFH-1株的相同区的序列的嵌合核酸构成的RNA。还未得到J6CF株的研究所必需的、以J6CF株的基因组作为骨架、且具有产生感染性HCV颗粒的能力的全基因组复制子RNA。如上所述，在来自基因型2a的HCV的亚基因组复制子RNA或全基因组复制子RNA中，迄今为止还不存在反映JFH-1株以外的HCV株的复制机制或复制效率的复制子RNA。因此，作为新的抗HCV药的靶的HCV复制所必需的因子的鉴定、或不依赖于复制机理或复制效率而能够发挥药效的抗HCV药的筛选难以进行。另外，可以人工制造的、作为HCV疫苗的原料的HCV颗粒的种类也有限定。现有技术文献 专利文献 专利文献1:日本特开2001-17187号公报； 非专利文献 非专利文献 1:Simmonds 等人，Hepatology, 1994 年，第 10 卷，第 1321-1324 页； 非专利文献2 =Choo等人，Science, 1989年，第244卷，第359-362页； 非专利文献3 =Kato等人，J.Med.Virol.，1992年，第64卷，第334-339页； 非专利文献 4 =Okamoto 等人，J.Gen Virol.，1992 年，第 73 卷，第 673-679 页； 非专利文献 5:Yoshioka 等人，Hepatology, 1992 年，第 16 卷，第 293-299 ； 非专利文献 6:Mori 等人，Biochem.Biophys.Res.Commun., 1992 年，第 183 卷，第 334-342 页； 非专利文献7:Lohmann等人，Science, 1999年，第285卷，第110-113页; 非专利文献8:Blight等人，Science, 2000年，第290卷，第1972-1974页； 非专利文献 9:Friebe 等人，J.Virol., 2001 年，第 75 卷，第 12047-12057 页； 非专利文献10:1keda等人，J.Virol., 2002年，第76卷，第2997-3006页； 非专利文献 11:Kato 等人，Gastroenterology, 2003 年，第 125 卷，第 1808-1817页； 非专利文献 12:Wakita 等人，Nature Medicine, 2005 年，第 11 卷，第 791-796页； 非专利文献 13:Murayama 等人，J.Virol., 2007 年，第 81 卷，第 8030-8040 页； 非专利文献 14:Murayama 等人，PLoS Pathogens., 2010 年，第 6 卷，el000885。
技术实现思路
专利技术所要解决的课题 本专利技术的课题在于:提供以丙型肝炎病毒J6CF株基因组作为骨架且具有自主复制能力的复制子RNA。解决课题的方法 本专利技术人等为了解决上述课题反复进行了深入研究，结果发现:以J6CF株的前体蛋白的氨基酸序列为基准时，第1680位的丙氨酸取代成谷氨酸的氨基酸取代在赋予J6CF株基因组自主复制能力上较为重要，从而完成了本专利技术。即,本专利技术包含以下内容。[I]核酸，该核酸从5’侧往3’侧依次包含:丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的5’非翻译区；包含NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列和NS5B蛋白编码序列的病毒蛋白编码区；以及3’非翻译区，而且 当以SEQ ID NO: 30所示J6CF株的前体蛋白的氨基酸序列为基准时，上述NS4A蛋白编码序列具有第1680位的丙氨酸取代本文档来自技高网...
【技术保护点】
核酸，该核酸从5’侧往3’侧依次包含：丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的5’非翻译区；包含NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列和NS5B蛋白编码序列的病毒蛋白编码区；以及3’非翻译区，其中，以SEQ ID NO: 30所示J6CF株的前体蛋白的氨基酸序列为基准时，上述NS4A蛋白编码序列具有第1680位的丙氨酸取代成谷氨酸的突变。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.05.31 JP 2011-1227951.核酸，该核酸从5’侧往3’侧依次包含:丙型肝炎病毒J6CF株的基因组的5’非翻译区；包含NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列和NS5B蛋白编码序列的病毒蛋白编码区；以及3’非翻译区，其中， 以SEQ ID NO: 30所示J6CF株的前体蛋白的氨基酸序列为基准时，上述NS4A蛋白编码序列具有第1680位的丙氨酸取代成谷氨酸的突变。2.权利要求1所述的核酸，其中，以SEQID NO: 30所示氨基酸序列为基准时，上述NS5B蛋白编码序列具有引起下述(i)~(iii)的氨基酸取代的突变， 当以SEQ ID NO: 29所示核苷酸序列为基准时，上述3’非翻译区的第9458位的胞嘧啶碱基取代成鸟嘌呤碱基， (i)第2892位的丙氨酸取代成丝氨酸的氨基酸取代； (?)第2959位的精氨酸取代成赖氨酸的氨基酸取代； (iii)第3003位的酪氨酸取代成苯丙氨酸的氨基酸取代。3.权利要求1所述的核酸，其中，上述NS5B蛋白编码序列被取代成编码由SEQID NO:27所示氨基酸序列的第I位~第515位的氨基酸序列和SEQ ID NO: 28所示氨基酸序列的第516位~第591位的氨基酸序列依次连接的氨基酸序列构成的蛋白的核苷酸序列，并且 上述3’非翻译区被取代成SEQ ID NO: 31所示核苷酸序列。4....
【专利技术属性】
技术研发人员：胁田隆字，村山麻子，加藤孝宣，
申请(专利权)人：日本国立感染症研究所， 东丽株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP
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