核酸扩增制造技术

本发明专利技术公开了一种监测核酸扩增的方法，所述方法通过以下步骤实现：将核酸和等温试剂盒的扩增混合物提供至pH传感器或pH指示剂，采用等温扩增对所述核酸进行扩增，并且使用所述pH传感器或pH指示剂检测由于扩增引起的pH变化。所述试剂盒包括镁盐、季铵盐和碱金属碱。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术公开了一种监测核酸扩增的方法，所述方法通过以下步骤实现：将核酸和等温试剂盒的扩增混合物提供至pH传感器或pH指示剂，采用等温扩增对所述核酸进行扩增，并且使用所述pH传感器或pH指示剂检测由于扩增引起的pH变化。所述试剂盒包括镁盐、季铵盐和碱金属碱。【专利说明】核酸扩增
本专利技术涉及对一定量的核酸进行扩增的方法和试剂盒。本专利技术特别地涉及等温扩增技术。经扩增的核酸可以被传感器检测到。
技术介绍
在进行遗传分析时，往往由于样品中存在的拷贝数太少而无法进行检测，通常需要对样品中的拷贝数进行扩增。例如，可以采用热循环扩增或等温扩增完成这个过程。等温扩增技术包括SDA、LAMP、SMAP、ICAN、SMART。通过链置换反应在恒温下进行该反应过程。通过在恒温下孵育包含样品、引物、具有链置换活性的DNA聚合酶以及底物的混合物，可以一步完成扩增。在环介导等温扩增(LAMP)技术中，采用4至6个被特别设计为分别识别靶基因中的6至8个特定区域的不同引物，来完成祀特异性扩增。Eiken Chemical的专利EP2045337 “Process for synthesizing nucleic acid” 中进一步描述了 LAMP 技术，在此通过引用的方式将其并入本文中。这种方法通常能够在15-60分钟内将核酸拷贝扩增IO9-1Ow倍。除了引物之外，链置换技术使用Tris和硫酸盐化合物(例如MgSO4、NH4SO4)来保持酶的功能性。 Tris为具有式(HOCH2)3CNH2的有机化合物(正式名称为三(羟甲基)氨基甲烷)。诸如LAMP之类的链置换技术使用Tris作为缓冲剂，使反应维持在最佳pH值。Tris和硫酸盐的推荐浓度分别为大于等于20mM和12_20mM。核酸扩增后，核酸检验需要二级检测技术，例如分光光度法、浊度法、LFD (横向流动试纸条法)或荧光素酶法。然而，这些已知的技术存在缺陷。荧光试剂需要标记以发出紫外荧光，因而耗费昂贵。此外，诸如SYBR绿等试剂与DNA结合，使其本身具有致癌性；埃姆斯试验(Ames Test)表明其具有致突变性和细胞毒性。而且，SYBR绿是非特异性的，其可以附着在任意双链DNA上，因此增强了背景信号。浊度测量需要昂贵的仪器以提供量化。最后，LFD中所用试剂需要二次偶联，其对非特异性检测敏感。现有的等温扩增技术不适用于采用pH检测的体系。因此，该领域存在这样的需求:需要一种对核酸进行等温扩增并且能够利用安全廉价的设备有效地对其进行检测的试剂盒和方法。令人惊讶的是，专利技术人已经发现所用的试剂可以提高扩增的产量。
技术实现思路
根据本专利技术的第一个方面，提供了一种试剂盒，其中的试剂可组合形成用于核酸等温扩增的混合物，所述试剂盒包括:镁盐、季铵盐和碱金属碱。所述混合物的缓冲容量可以被设置为小于用扩增时释放的质子的期望浓度除以PH变化阈值得到的值，所述pH变化是通过暴露于所述混合物的传感器检测得到的。所述混合物的缓冲容量可以被设置为小于用扩增时释放的质子的期望浓度除以PH变化阈值所得值的一半，所述pH变化阀值是通过暴露于所述混合物的传感器检测得到的。所述待检测的pH变化阈值可以为所述感受器的检测限值。在用于所述扩增的操作条件下，所述混合物的缓冲容量可以小于10mM，优选地小于5mM，更优选地小于ImM。所述混合物中的缓冲剂的浓度可以小于5禮，更优选地小于3mM、小于2mM或小于ImM0如果存在硫酸盐化合物的话，其浓度可以小于15mM，优选地小于10mM、小于8mM、小于5mM或小于ImM。所述季铵盐的浓度为介于2mM和15mM之间，所述季铵盐优选为氯化铵。所述碱金属碱的浓度使得所述混合物的pH介于6和9之间，优选地介于7和8.8之间，更优选地介于8.3和8.6之间。所述碱金属碱为NaOH、KOH或LiOH之一。在核酸扩增过程中还可以使用一种或多种引物，所述引物为等位基因特异性的，从而使得扩增能够显示目标核酸的存在。所述等温扩增可以为链置换扩增，优选为环介导等温扩增(LAMP)。所述混合物的缓冲容量可以基本上屏蔽(mask)非扩增时所释放的质子的预期量。所述试剂盒还可以具有链置换酶、核苷酸和引物，其中优选地这些试剂中的至少一种与其余试剂分开存放。根据本专利技术的第二个方面，提供了一种方法:使用用于等温扩增的试剂盒、pH传感器或PH指示剂；采用等温扩增对核酸进行扩增；以及使用所述pH传感器或pH指示剂检测由于所述扩增引起的PH变化。所述pH指示剂可以为比色染料或荧光染料，所述pH传感器可以为离子敏感场效应晶体管(ISFET)。所述方法可以确定使混合物的pH变化大于预定的变化量所需要的反应时间；以及基于所述反应时间对核酸的初始浓度进行定量。所述混合物可以与参比电极流体连通，所述参比电极优选为银-氯化银电极。所述混合物可以包含一种或多种等位基因特异性引物，所述引物具有至少一个与所述核酸的目标单核苷酸多态性(SNP)互补的碱基，所述方法还包括根据是否进行扩增来鉴定所述核酸的所述至少一个碱基，所述扩增是否进行由PH传感器或pH指示剂检测。所述扩增可以改变所述混合物的质子浓度使其变化量大于所述混合物的缓冲容量的10%。根据本专利技术的第三个方面，提供了一种方法，其包括使用所述新的试剂盒对核酸进行等温扩增。【专利附图】【附图说明】 下文将结合附图，通过例子对本专利技术的具体实施方案进行描述，其中:图1为链置换扩增技术(如LAMP)的一系列化学反应；图2为暴露于样品的ISFET的剖面图；图3为pH检测系统的剖面图；图4为监测DNA样品扩增以鉴定DNA (选项A)或计算DNA的量(选项B )的方法的流程图；图5为示出常规LAMP配方中试剂的缓冲容量的图；图6为示出不同浓度的NH4Cl的缓冲容量的图；以及图7为用于定量样品中的DNA的标准曲线图。常规LAMP扩增方法使用具有置换活性的DNA聚合酶在标准检验条件下进行，例如:20mM Tris-HCl(pH8.8)UOmM KCl、IOmM(NH)4SO4'2.5mM MgS04、0.l%Triton Χ_100、0.8M甜菜碱、DNA/RNA、dNTP和Bst聚合酶。本专利技术人发现这些常规试剂使得无法使用pH传感器进行检测，这主要是因为它们能够屏蔽扩增时产生的质子。事实上，所有这些组分具有不同的pKa，这意味着它们对所述混合物的缓冲容量具有不同的影响。上述提到的试剂中，TrisHCl具有吸收抗衡离子(H+和0H_)的能力，从而帮助溶液保持在聚合酶起作用的最佳PH范围内的稳定pH水平。本专利技术人发现，用NaOH替代TrisHCl可以将pH设定在聚合酶(例如Bst)可以起作用的范围内，同时降低了缓冲容量。此外，NaOH使双链DNA中的两条链不那么紧密地结合，使得置换聚合酶更容易将它们分开，从而加速反应并提高链置换酶的效率。此外，电子传感器(例如`ISFET)使用参比电极,例如钼、Ag/AgCl、氯化亚萊等。这些材料中的一些材料，特别是Ag/AgCl电极与所述标准试剂反应。例如，通过Ag/AgCl电极,Tris在该电极上形成Tris-Ag络合物,其使Ag/AgCl的性能劣化,并且含硫酸盐的试剂会使Ag/AgCl电极中毒。专利技术详述使用本专利技术方法的优选的体系包括本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种试剂盒，其中的试剂可组合形成用于核酸等温扩增的混合物，所述试剂盒包括：镁盐、季铵盐和碱金属碱。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛里奇奥·拉姆拉，安吉尔·王，阿尔佩什·帕特尔，
申请(专利权)人：DNA电子有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB