抗人乳头瘤病毒的三价疫苗及其制法和用途制造技术

本发明专利技术涉及抗人乳头瘤病毒的三价疫苗及其制法和用途。具体地，本发明专利技术通过大量筛选和分析kozak序列，发现具有大幅度提高HPVL1蛋白表达水平的kozak序列；并对人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1(HPV?L1)的16、18和58基因进行重新设计和序列优化，排除影响翻译的mRNA的二级结构，并据此构建高表达的HPV?L1基因表达盒，所述表达盒尤其适用于在毕赤酵母中表达，并具有蛋白表达量高、稳定性好的特点。

【技术实现步骤摘要】
抗人乳头瘤病毒的三价疫苗及其制法和用途
本专利技术涉及基因工程和疫苗学领域，具体地，本专利技术涉及抗人乳头瘤病毒的三价疫苗及其制法和用途。
技术介绍
宫颈癌是常见的妇科恶性疾病，在最常见的妇女癌症中，宫颈癌的发病率高居第二。HPV（乳头瘤病毒）病毒感染与宫颈癌的发生密切相关，人类至今已经分离到了至少118种乳头瘤病毒。目前已证实，在肛生殖系统癌症中，由HPV感染所诱发的癌症占3.7%。在已被分离出的HPV病毒亚型中，已发现有15种具有诱导生殖系统癌症的发生，因而被归为高危性HPV病毒亚型(如HPV16,18,31,33,52和58)，其中HPV16和HPV18两种亚型在全世界占所有由HPV感染诱发宫颈癌的70%。继HPV16和HPV18之后，HPV58和HPV52在亚洲和非洲具有高患病率，占全世界宫颈癌发病率的2-3%。大规模中国妇女HPV病毒亚型分布分析表明，整体上HPV的患病率(包括高危和低危HPV病毒亚型)在侵入性子宫颈癌(ICC)为82.7%，在高度鳞状上皮内病变(HSIL)中为88.5%，在低度鳞状上皮内病变(LSIL)为69.3%。HPV是一种DNA病毒，直径约为45-55nm，呈球形，无包膜，衣壳为72个壳微粒组成对称偏斜的20面体，其病毒颗粒衣壳由主要衣壳蛋白(L1)和次要衣壳蛋白(L2)组成。主要衣壳蛋白L1在细胞中表达后能自动组装成衣壳颗粒，称为病毒样颗粒(VLPs)，该颗粒与天然病毒有相似的空间构象、免疫特性和生物学活性，并可以大规模制备和纯化。含不同亚型或混合型HPV的VLPs/L1蛋白预防性疫苗已相继被成功研制并开始在临床实验上使用。美国默克公司研究出了含有HPV6、HPV11、HPV16和HPV18的四价疫苗(商品名Gardasil)，已获FDA批准并在美国上市，英国的葛兰素史克公司也研究出了含有HPV16和HPV18的两价疫苗。但是，就目前的HPV疫苗的生产工艺而言，大多采用大肠杆菌、酿酒酵母（如Merk公司）或昆虫细胞（如葛兰素史克公司）作为反应器进行生产。大肠杆菌表达的L1蛋白不能被正确折叠和修饰，并以包涵体的形式表达，因此要组装成病毒样颗粒L1蛋白需要经过变性和复性的过程，纯化工艺复杂，同时体外组装的病毒样颗粒的免疫原性低于真核表达并自主组装的病毒样颗粒。用酿酒酵母生产HPV的VLP也存在一些明显的缺点，例如，酿酒酵母中的外源HPVL1基因存在于质粒而非染色体上，导致分泌效率差、表达菌株不够稳定、在生产过程中易发生质粒丢失等现象。此外，酿酒酵母的分泌蛋白平均每条侧链有50-150个甘露糖残基，这种过度的糖基化导致所生产的VLP在某些个体中产生不利的过敏反应；酿酒酵母无法采用高密度发酵，发酵成本很高。目前为止，还没有人体对具有不同基因型的各HPV病毒亚型之间存在交叉反应的报道，因此针对某一病毒亚型的特异性疫苗通常只能使得接种者对该特定病毒亚型有预防效果。为使易感人群或患者具有针对抗一种以上病毒亚型(尤其是多种高危HPV)的预防免疫功能或治疗效果，迫切需要对该人群联合施用针对几种相应的不同病毒亚型疫苗。总之，本领域目前尚缺乏低成本、高效率的多种HPVL1蛋白或VLP的制备方法，因此迫切需要开发新的高效、简便、低成本地制备HPV的L1蛋白或VLP的方法，尤其是制备同时含有HPV16、HPV18和HPV58的L1蛋白或VLP的方法，以便能够开发针对多种特定亚型的疫苗。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供非常适于在毕赤酵母中表达HPVL1蛋白的kozak序列以及HPVL1表达盒。本专利技术的另一目的是提供一种优化的人乳头瘤状病毒16、18和58L1蛋白的核酸序列。本专利技术的另一目的是提供一种制备抗人乳头瘤状病毒的疫苗的制备方法。在本专利技术的第一方面，提供了一种编码人乳头瘤病毒HPV的主要衣壳蛋白L1的核酸分子，所述的核酸分子选自下组：(1)核酸分子的序列如SEQIDNO.:3所示，或与SEQIDNO.:3所示序列的同源性≥95%（较佳地≥98%，更佳地≥99%），且编码的氨基酸序列与SEQIDNO.:2相同或基本相同；(2)核酸分子的序列如SEQIDNO.:6所示或，或与SEQIDNO.:6所示序列的同源性≥95%（较佳地≥98%，更佳地≥99%），且编码的氨基酸序列与SEQIDNO.:5相同或基本相同；(3)核酸分子的序列如SEQIDNO.:9所示，或与SEQIDNO.:9所示序列的同源性≥95%（较佳地≥98%，更佳地≥99%），且编码的氨基酸序列与SEQIDNO.:8相同或基本相同。在另一优选例中，所述的基本相同为氨基酸序列的同源性≥98%，较佳地≥99%。在另一优选例中，序列如SEQIDNO.:3所示的核酸分子编码野生型人乳头瘤病毒HPV16L1蛋白。在另一优选例中，序列如SEQIDNO.:6所示的核酸分子编码野生型人乳头瘤病毒HPV18L1蛋白。在另一优选例中，序列如SEQIDNO.:9所示的核酸分子编码野生型人乳头瘤病毒HPV58L1蛋白。在本专利技术的第二方面，提供了一种人乳头瘤病毒HPV的主要衣壳蛋白HPVL1的表达盒，所述表达盒的5’-3’依次具有下述元件：kozak序列、HPVL1编码序列、和终止子。在另一优选例中，所述的kozak序列为：5’-(A/T)A(A/C)AA(A/C)ATGTC(T/C)-3’。在另一优选例中，所述的kozak序列任选自SEQIDNO.:10-25，较佳地任选自SEQIDNO：10、12、14或22，更佳地为SEQIDNO：10。在另一优选例中，所述HPVL1编码序列选自下组：(1)序列如SEQIDNO.:3所示，或与SEQIDNO.:3所示序列的同源性≥95%（较佳地≥98%），且编码的氨基酸序列与SEQIDNO.:2相同或基本相同；(2)序列如SEQIDNO.:6所示，或与SEQIDNO.:6所示序列的同源性≥95%（较佳地≥98%），且编码的氨基酸序列与SEQIDNO.:5相同或基本相同；(3)序列如SEQIDNO.:9所示，或与SEQIDNO.:9所示序列的同源性≥95%（较佳地≥98%），且编码的氨基酸序列与SEQIDNO.:8相同或基本相同。在本专利技术的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有本专利技术第一方面所述的核酸分子或本专利技术第二方面所述的表达盒。在另一优选例中，所述载体为pPIC3.5和pPIC3.5K，较佳地为pPIC3.5K。在本专利技术的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本专利技术的第三方面所述的载体或染色体整合有本专利技术第一方面所述的核酸分子或本专利技术第二方面所述的表达盒。在另一优选例中，所述宿主细胞为毕赤酵母。在另一优选例中，所述宿主细胞的染色体具有1-50个拷贝的本专利技术第一方面所述的核酸分子或本专利技术第二方面所述的表达盒。在另一优选例中，所述宿主细胞的染色体具有2-10个拷贝，较佳地3-7个拷贝的本专利技术第一方面所述的核酸分子或本专利技术第二方面所述的HPVL1基因表达盒。在本专利技术的第五方面，提供了一种制备人乳头瘤病毒HPVL1蛋白的方法，包括步骤：(i)在适合的条件下，培养本专利技术的第四方面所述的宿主细胞，所述宿主细胞为毕赤酵母，从而表达出人乳头瘤病毒HPVL1蛋白；和(ii)分离所述蛋白。在另一优选例中，所述的人乳头瘤病本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种编码人乳头瘤病毒HPV的主要衣壳蛋白L1的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子选自下组：(1)核酸分子的序列如SEQ?ID?NO.:3所示，或与SEQ?ID?NO.:3所示序列的同源性≥95%（较佳地≥98%，更佳地≥99%），且编码的氨基酸序列与SEQ?ID?NO.:2相同或基本相同；(2)核酸分子的序列如SEQ?ID?NO.:6所示或，或与SEQ?ID?NO.:6所示序列的同源性≥95%（较佳地≥98%，更佳地≥99%），且编码的氨基酸序列与SEQ?ID?NO.:5相同或基本相同；(3)核酸分子的序列如SEQ?ID?NO.:9所示，或与SEQ?ID?NO.:9所示序列的同源性≥95%（较佳地≥98%，更佳地≥99%），且编码的氨基酸序列与SEQ?ID?NO.:8相同或基本相同。

【技术特征摘要】
1.一种人乳头瘤病毒HPV的主要衣壳蛋白HPVL1的表达盒，其特征在于，所述表达盒的5’-3’依次具有下述元件：kozak序列、HPVL1编码序列、和终止子；其中，所述的kozak序列为SEQIDNO.10；所述HPVL1编码序列如SEQIDNO.3所示。2.一种人乳头瘤病毒HPV的主要衣壳蛋白HPVL1的表达盒，其特征在于，所述表达盒的5’-3’依次具有下述元件：kozak序列、HPVL1编码序列、和终止子；其中，所述的kozak序列任选自SEQIDNO.10、12、14或22；所述HPVL1编码序列如SEQIDNO.3所示。3.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1或2所述的表达盒。4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求3所述的载体或染色体整合有权利要求1或2所述的表达盒；其中，所述宿主细胞为毕赤酵母。5.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞的染色体具有1-50个拷贝的权利要求1或2所述的表达盒。6.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞的染色体具有2-10个拷贝的权利要求1或2所述的HPVL1基因表达盒。7.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞的染色体具有3-7个拷贝的权利要求1或2所述的表达盒。8.一种制备人乳头瘤病毒HPVL1蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：(i)在适合的条件下，培养权利要求4所述的宿主细胞，所述宿主细胞为毕赤酵母，从而表达出人乳头瘤病毒HPVL1蛋白；和(ii)分离所述蛋白。9.如权利要求8所述的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘卫庆，徐新东，张远斌，
申请(专利权)人：同济大学，
类型：发明
国别省市：