本发明专利技术主要提供了一个高粱蜡质合成调控基因，其核苷酸序列如文中SEQ?ID?NO：1所示，还涉及了该基因在拟南芥植株中的应用。转化所述基因的拟南芥，其叶片蜡质更厚，叶片有光泽，具有抗旱、抗病虫害等优点。
【技术实现步骤摘要】
一个高粱蜡质合成调控基因在拟南芥植株中的应用
本专利技术属于基因工程领域，涉及一个高粱蜡质合成调控基因在模式植物拟南芥中的应用。
技术介绍
植物表皮细胞的外面有一层结构，称为角质层。角质层为网状结构，有蜡质填充其间，这些填充在角质层网状结构内的蜡层被称为内蜡质层；在角质层外形成只有蜡质成分的结构，为外蜡质层，外蜡质层一般会形成自我组装的蜡质晶体。研究表明：被蜡质填充的角质层能够降低通过植物表面的水分散失，提高植物的抗旱性。角质层还在防止紫外线辐射伤害、抵抗病虫害的侵入方面起重要作用，此外，角质层的蜡质含量与花粉育性和一些农艺性状表现有关。为获得能显著提高农作物蜡质含量的基因，我们选用了蜡质含量较高的高粱为材料，进行蜡质合成相关基因的克隆。高粱属于禾本科，高粱属，1年生草本，植株表面常覆有明显的蜡质成分，使其具有广泛的适应性和较强的抗逆能力，是用于蜡质相关优良基因鉴定的理想材料。我们以拟南芥中调控蜡质合成的基因WIN1的序列为参考序列，克隆了高粱中的相应同源基因，命名为SbWIN1，并通过基因工程操作，将其转到拟南芥中，并处于组成型超表达启动子35S的控制下。表型鉴定的结果表明，转基因拟南芥的叶片的蜡质含量明显增加，叶片有光泽。采用扫描电镜对其进行深度形态学扫描，结果表明，叶片表面的蜡质晶体成分明显增多，高粱SbWIN1基因具有显著提高植物表面蜡质成分的能力，是进行农作物蜡质性状改良的一个重要候选基因。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一个高粱蜡质合成调控基因在拟南芥蜡质成分性状改变中的应用。本专利技术的技术方案如下：一个高粱蜡质合成调控基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示：AUGGUACAGCCAAAGAAGUUUCGUGGAGUCCGGCAGCGCCACUGGGGUUCCUGGGUCUCCGAGAUCAGGCAUCCCCUCCUUAAGAGGAGGGUCUGGCUGGGCACCUUCGAGACCGCUGAGGAGGCAGCGAGAGCAUAUGACGAGGCUGCCGUGCUGAUGAGCGGCCGCAACGCCAAGACCAACUUCCCGGUCCAAAGGAGCAGCACAGGGGAGCCAACCCCAGCUGCGGGAAGGGACGCUCACAGCAACGCCGGCAGCGGCUCCUCUACCGCCAACCUGUCCCAGAUUCUCAGUGCGAAGCUCCGCAAAUGCUGCAAGGCGCCAUCGCCCUCCCUGACCUGUCUCCGCCUUGACCCUGAGAAGUCCCACAUUGGUGUUUGGCAGAAGCGUGCAGGAGCCCGUGCUGACUCCAACUGGGUCAUGACCGUGGAGCUCAACAAAGGUGCAGCAUCCACUGAUGCUGCAUCACAGUCCACAUCAGCAACAACUGCUCCACCAGCCACCCCGAUGGAUGACGAGGAGAGGAUCGCCCUGCAAAUGAUCGAAGAGUUGCUGAGCAGCAGCAGCCCAGCUUCACCCUCGCACGGAGAUGACCAAGGUCGCUUCAUCAUCUGASEQIDNO：1所述基因根据拟南芥AtWIN1基因的序列，通过同源序列比对获得高粱的SbWIN1基因序列，通过扩增、连接、植物转化等分子生物学操作而获得。具体如下：采用生物信息学的方法，获得SbWIN1基因序列。利用PRIMER5设计引物用于扩增开放阅读框序列。提取高粱BTX623茎秆的RNA，将1μg的RNA逆转录为cDNA作为扩增的模板备用。用设计的特异引物进行扩增。将扩增的产物连接到克隆载体上。转入大肠杆菌，筛选阳性的进行测序，获得SEQIDNO：1所示的基因序列。将上述克隆到的基因连接到超表达载体，采用农杆菌介导转化方法，获得转基因拟南芥植株。结果表明转基因拟南芥叶片蜡质比普通的要厚，叶片有光泽。附图说明图1野生型拟南芥；图2是含有本专利技术序列表中序列1基因的拟南芥；图3野生型拟南芥的扫描电镜图；图4是含有本专利技术序列表中序列1基因的拟南芥电镜扫捕图。具体实施方式下面以高粱的茎秆作为试验材料详细说明制备方法。1.总RNA的提取采用TIANGEN试剂盒，操作步骤如试剂盒说明所示。得到RNA溶液后琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的质量，-80℃保存。2.cDNA的合成：cDNA的合成使用Invitrogen的SuperScriptTMIIIFirst-StrandSynthesisSystemforRT-PCR，步骤如下：1)取0.5ml灭菌微量离心管，分别加入以下成分：总RNA；OligldT；10mMdNTP。混匀，轻甩离心管，使溶液至底部；2)离心管置于水浴锅内，65℃保温5min；3)迅速取出置于冰上冷却1min以上，将离心管轻微离心；4)在上述离心管中加入下列反转录反应液：5×First-strandBuffer；0.1MDTT；RecombinantRNaseInhibitor；SuperScriptTMIIIRT；5)轻微震荡混匀后短暂离心；6)50℃保温50min；7)70℃保温15min，-20℃保存。高粱β-ActinF(GenBankaccessionNo.X79378)检测反转录产物。PCR扩增程序：94℃4min，35个循环的程序为95℃30s，60℃30s，72℃30s，最后72℃5min。2％琼脂糖凝胶电泳检测。3.SbWIN1的分离PCR扩增引物采用“Primer5.0”引物设计软件进行设计，并对得到的引物序列用VectorNTI进行分析，找出解链温度，自身互补性，两引物互补性合适的引物对。cDNA为模板，SbAGL6-F、SbAGL6-R为引物进行PCR扩增，PCR扩增体系为：反应总体系50μl，包括反转录产物，10×phushionHFbuffer，10mmol/LdNTPs，10mM基因特异引物，phusionDNA聚合酶，DMSO，剩余用水补齐。PCR扩增程序：98℃1min，35个循环的程序为98℃10s，47℃20s，72℃30s，最后72℃10min。本试验PCR扩增选用的是NEB公司的PhusionDNA聚合酶。4.PCR产物的加A连接利用PhusionDNA聚合酶产生的克隆片段为平末端，在进行TA克隆之前，可用另一种聚合酶Taq酶在平末端PCR产物末端进行加A。加入PCR回收产物、5×Taqbuffer、10mMdATP、Taq酶，72℃保持15分钟，取出2μl加A后的PCR回收产物加入2×T4连接酶缓冲液、pGEM-Teasy载体(50ng/μl)、T4DNA连接酶(3U/μl)连接到pGEM-Teasy载体上，pGEM-Teasy载体购自Promega公司。5.连接产物的转化1)从-80℃冰箱中取出1管(50μl)感受态细胞，置冰上。2)用预冷的无菌吸头向管中加入2μl连接反应物，轻轻摇匀，置冰上30分钟。3)42℃水浴热激60秒，迅速置冰上5分钟。4)向离心管中加入SOC液体培养基，混匀后37℃振荡培养1h。5)室温下8000rpm离心5分钟，弃掉上清液，将剩余上清液重新悬浮菌体，用涂布器将其均匀涂到X-gal+IPTG+Amp的平板上，放置30分钟。6)倒置平板于37本文档来自技高网...
【技术保护点】
一个高粱蜡质合成调控基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。
【技术特征摘要】
1.一种高粱蜡质合成调控基因在制备具有蜡质合成调控能力的拟南芥植株中的应用，其特征在于：所述高粱蜡质合成调控基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.如权利要求1所述的一...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢晓东，孙守钧，包曙光，罗峰，丁博，傅扬，王锐，
申请(专利权)人：天津农学院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。