一种棉花叶片蛋白质提取方法技术

本发明专利技术提供了一种棉花叶片蛋白质提取方法，包括以下步骤：1）取棉花叶片，研磨；2）经研磨的叶片粉末转入离心管中，并加入三氯乙酸提取液，混合均匀，放在－20℃冰箱中两小时以上；3）离心管离心，弃上清，留沉淀，向沉淀中加入-20℃预冷丙酮溶液，混合均匀，于-20℃静置2～4h；4）离心管离心，弃上清，留沉淀，洗涤沉淀，并保留沉淀；5）沉淀抽真空，挥发丙酮，得到蛋白质干粉；6）取干燥的蛋白粉末，加入蛋白裂解液，35℃的水浴中裂解1h，离心，取上清，所述上清为棉花叶片蛋白溶解液。本发明专利技术所述棉花叶片蛋白质提取方法提取的蛋白质稳定,重复性好，且蛋白质纯度较高,电泳图谱显示几乎没有横条纹和拖尾等纹理现象。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物化学领域，尤其涉及。
技术介绍
棉花是世界上最重要的天然纤维作物，也是重要的油料作物；同时棉花也是世界性的重要的经济作物，在国民经济中占有重要的地位。棉花能制成各种规格的纺织物，这些纺织物具有穿着舒适，坚牢耐磨，能洗涤并在高温下熨烫等特点。因此，棉花具有巨大的应用价值和开发潜力。棉花作为一种重要的经济和油料作物，在其进行大量的分子标记和QTL等研究后，对它开展蛋白质组研究就显得十分迫切，也更为可行。但棉花中含有大量的色素、酚、醌等一些次生代谢产物，严重影响所提蛋白的纯度，从而影响棉花蛋白质领域的研究，以及影响棉花产业的发展。因此，在提取蛋白质时应尽可能的除去这些物质的干扰，对解决棉花产业发展中遇到的技术问题具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，该方法提取的棉花叶片蛋白纯度高，适合后续研究工作的开展，利于促进棉花产业发展。一种棉花 叶片 蛋白质提取方法，包括以下步骤:I)取棉花叶片，用液氮研磨；2)经液氮研磨的叶片粉末转入离心管中，并加入预冷的三氯乙酸提取液，混合均匀，放在一 20°C冰箱中两小时以上，每半小时震荡一次；3)离心管离心，弃上清，留沉淀，向沉淀中加入_20°C预冷丙酮溶液，混合均匀，于-20°C静置2~4h ；4)离心管离心，弃上清，留沉淀，洗涤沉淀，并保留沉淀；5)沉淀抽真空，挥发丙酮，得到蛋白质干粉；6)取干燥的蛋白粉末，加入蛋白裂解液，35°C的水浴中裂解lh，离心，取上清，所述上清为棉花叶片蛋白溶解液。所述三氯乙酸提取液的配方为:10%TCA，0.07%-0.1%DTT,0.5% β-巯基乙醇，lmmol/L PMSF，溶剂为丙酮。所述丙酮溶液含有0.07%-0.1%DTT 和 lmmol/L PMSF。所述蛋白裂解液的配方为:7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4%CHAPS, 80mmol/LDTT, lmmol/L PMSF, 0.3%载体两性电解质。用液氮研磨叶片时加入PVPP和石英砂。所述三氯乙酸提取液的用量是每0.4克叶片加入1.SmL预冷三氯乙酸提取液。步骤4)所述沉淀重复洗涤3次或3次以上，或过夜洗涤，至接近白色。所述蛋白裂解液的用量是每毫克干燥蛋白干粉加入蛋白裂解液20 μ I。本专利技术所述棉花叶片蛋白质提取方法提取的蛋白质稳定，重复性好，且蛋白质纯度较高，电泳图谱显示几乎没有横条纹和拖尾等纹理现象，清晰，圆润。【附图说明】图1不同提取方法对棉花叶片蛋白质2-DE图谱的影响，A:酹法，B =TCA/丙酮法，C:改良的TCA/丙酮法；图2不同上样量对棉花叶片蛋白质2-DE图谱的影响(IPGpH4-7，18cm)；图3不同上样量对棉花叶片蛋白质2-DE图谱的影响(IPGpH4_7，24cm)。【具体实施方式】以下结合具体实施例对本专利技术的技术路线做进一步详细说明。本专利技术用到的材料:植物材料:棉花品种“KK1543”，由新疆农业大学农学院作物遗传实验室提供。实施例1棉花叶片获取选取籽粒饱满且脱绒干净的棉花种子处理后放入三角瓶里，浸种24小时，待种子露白后转入放有两层滤纸的发芽盒中，并保持发芽盒湿润，待长出两片子叶后，选取长势健壮，均一的棉苗转入l/2Hoagland培养液中，人工气候室水培。培养条件为温度为28/25C(白天/晚上)，光强为120001x以上光照350~400，每天光照10小时，相对湿度为60~80%。每隔4d换一次培养液，并注意清洗根部和盆子等处的青苔,培养半个月后取其叶片，用纯水，去离子水依次清洗干净，用滤纸吸干水后，于液氮中速冻后置于-80°C超低温冰箱保存，待用。本实施例所用棉花为KK1543。实施例2棉花叶片蛋白提取将洗净的研钵用酒精灯烧三分钟放于_20°C冰箱中预冷后，加入I~2g材料，适量的PVPP和少许石英砂，用液氮研磨充分，直至粉末泛白即可。转入几个2mL离心管中(每管约0.4g)，每管中加入1.8mL预冷的三氯乙酸提取液中充分混合后，放在一 20°C冰箱中两小时以上，并约半小时震荡一次。4°C, 13000r/min离心15min,弃上清,取沉淀。将沉淀用枪头捣碎后加入1.8mL的_20°C预冷丙酮(含0.07%-0.1%DTT，lmmol/LPMSF)，混匀后于_20°C静置2~4h.，同上离心，弃上清，取沉淀，重复洗涤3次。最后取沉淀，如果发现有仍有粉色则可再过夜，直到沉淀颜色接近白色为止。得到沉淀后均用parafilm封口，用针在膜上扎几个小洞，真空机中抽真空，挥发丙酮之后成为蛋白质干粉。取适量干燥后的样品粉末，按20 μ Ι/mg的比例加入蛋白裂解液后，涡旋器上震荡成粘稠状，然后放在35°C (不能高于36°C)的水浴中裂解lh，不时振荡。试管拿出后，室温下13000r/min离心15min，取上清(重复一次)，得到棉花叶片蛋白溶解液，放于一 80°C保存。三氯乙酸提取液配方如下:10%TCA，0.07%-0.1%DTT,0.5% β -巯基乙醇，Immol/LPMSF，溶剂为丙酮蛋白裂解裂解液配方如下:7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4%CHAPS，80mmol/LDTT, lmmol/LPMSF, 0.3% 载体两性电解质。本实施例所述棉花叶片蛋白提取方法命名为改良的TCA/丙酮沉淀法。对照例I酚抽提法提取棉花叶片蛋白质取用蒸馏水冲洗干净的棉花叶片约3g，加入0.2g聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpoly pyrrolidone, PVPP)后，在研钵中加入液氮冷冻研磨成粉后取Ig粉末加入到无菌的IOmL大离心管中，加入4~5倍体积的蛋白质提取缓冲液(50mmol/LTris,50mmol/LEDTA, 100mmol/LKCl, lmmol/LPMSF,体积分数2%P -疏基乙醇)混匀，加入等体积PH8.0 Tris-饱和酚，充分涡旋后，离心(4°C，，12000r/min)离心20min ;回收酚相转至一新的离心管，各加入50mL乙酸铵甲醇溶液(0.lmol/L), -20°C沉淀2h以上或过夜。4°C，15000r/min离心20min，弃上清液，沉淀用丙酮(含体积分数2% P -巯基乙醇，-20°C )洗涤I次，-20°C放置至少Ih后，重复以上步骤一次，弃上清，留蛋白沉淀。对照例2 TCA/丙丽法提取棉花叶片蛋白质取用蒸馏水冲洗干净的棉花叶片约2.5g，迅速在液氮中研磨后加入3倍体积_20°C预冷的含50% (w/v) TCA (三氯乙酸)的水溶液，上下剧烈颠倒，于4°C静置2h以上，离心(4°C，12000r/min) 20min，弃上清；将沉淀悬浮于_20°C预冷的含0.1 % DTT (二硫苏糖醇)的丙酮溶液中，蜗旋并在_20°C沉淀2h，离心(4°C，12000r/min)20min，弃上清。重复3次,最后弃上清，留蛋白沉淀。实施例3所提取蛋白叶片蛋白纯度检测检测方法:1.蛋白质定量`用1%BAS (牛血清蛋白)做标准蛋白，0.01%考马斯亮蓝G250，含5%乙醇(浓度为95%)，10%磷酸染色，在紫外分光光度计上以595nm波长下测定OD值绘制标准曲线。依据标准曲线计算样品蛋白质浓度。2.水化将置于超低温冰箱下的蛋白样品室温下解冻后，向离心管中加本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种棉花叶片蛋白质提取方法，包括以下步骤：1）取棉花叶片，用液氮研磨；2）经液氮研磨的叶片粉末转入离心管中，并加入预冷的三氯乙酸提取液，混合均匀，放在－20℃冰箱中两小时以上，每半小时震荡一次；3）离心管离心，弃上清，留沉淀，向沉淀中加入?20℃预冷丙酮溶液，混合均匀，于?20℃静置2～4h；4）离心管离心，弃上清，留沉淀，洗涤沉淀，并保留沉淀；5）沉淀抽真空，挥发丙酮，得到蛋白质干粉；6）取干燥的蛋白粉末，加入蛋白裂解液，35℃的水浴中裂解1h，离心，取上清，所述上清为棉花叶片蛋白溶解液。

【技术特征摘要】
1.一种棉花叶片蛋白质提取方法，包括以下步骤: 1)取棉花叶片，用液氮研磨； 2)经液氮研磨的叶片粉末转入离心管中，并加入预冷的三氯乙酸提取液，混合均匀，放在- 20°C冰箱中两小时以上，每半小时震荡一次； 3)离心管离心，弃上清，留沉淀，向沉淀中加入-20°C预冷丙酮溶液，混合均匀，于-20°C静置2~4h ; 4)离心管离心，弃上清，留沉淀，洗涤沉淀，并保留沉淀； 5)沉淀抽真空，挥发丙酮，得到蛋白质干粉； 6)取干燥的蛋白粉末，加入蛋白裂解液，350C的水浴中裂解lh，离心，取上清，所述上清为棉花叶片蛋白溶解液。2.根据权利要求1所述的一种棉花叶片蛋白质提取方法，其特征在于，所述三氯乙酸提取液的配方为:10%TCA,0.07%-0.1%DTT,0.5% 3 -巯基乙醇，lmmol/L PMSF，溶剂为丙酮。3.根据权利要求1所述的一种棉花叶片蛋白质提取方法，其特征在于，所述丙酮溶液含有 0.0...

【专利技术属性】
技术研发人员：曲延英，陈全家，郭忠军，孙国清，
申请(专利权)人：新疆农业大学，
类型：发明
国别省市：