一种提高湖州铁线莲悬浮细胞培养物中总黄酮的方法技术

本发明专利技术涉及一种提高湖州铁线莲悬浮细胞培养物中总黄酮的方法。该方法包括如下步骤：（1）单细胞的获取：选择铁线莲植株叶片，消毒后研磨，过滤得到沉淀的单细胞；（2）初代培养：把单细胞加入到液体MS培养基中，培养基中抗生素和抗真菌农药，放入摇床中培养；（3）固体培养：将细胞悬浮培养液用筛网过滤，得到单细胞悬浮液，将单细胞悬浮液与固体MS培养基混合，混合液倒入培养皿中，培养皿置于培养箱中培养；（4）继代培养：挑取生长良好的单细胞团接入液体MS培养基中培养；（5）发酵培养：继代培养15±3天后，将培养物置于4-10℃冷处理8-12小时，再常规培养7±2天。该方法能将细胞培养物中的总黄酮含量提高5倍左右。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞培养法生产天然产物
，具体为。
技术介绍
湖州铁线莲为毛茛科Ranuncul aceae铁线莲属植物，别名:吴兴铁线莲，河边威灵仙，金剪刀，金剪刀草，铜脚威灵仙等。形态特征为:草质藤本，茎有6棱，疏生弯曲的短柔毛或后变无毛；叶为单数羽状复叶，小叶9片，最下面的小叶长1.2~~1.5寸，3深裂或3全裂，裂片狭卵形，全缘，上面无毛，下面有贴生的短粗毛，而叶脉上的毛较密，其他小叶逐渐变小，2或3裂，或不裂；茎上部的叶较少，小叶7片，卵形至圆卵形，花I至3朵成腋生的聚伞花序，花梗有对生的苞片2片，3裂或不裂；萼片4，白色，短圆状倒披针形，外面有毛；雄蕊多数，花丝短而宽；雌蕊约12枚，密生长柔毛；花期7月。湖州铁线莲主要分布在浙江东北部平原地区，常生沟边、河岸潮湿地方，夏、秋季采全草鲜用，或晒干备用，性辛、温，具有祛风湿，通络止痛，抗癌，天灸等功效，可以用于治疗脑瘤、深部脓肿、风湿关节痛等。野生湖州铁线莲在湖州的分布范围很窄，自然繁殖缓慢，加上生长环境不断恶化，野生资源已濒衰竭，人工栽培方法虽然能解决数量问题，但是人工栽培过程中，没有办法控制药材中有效成分的含量，造成药材质量的不稳定，采用细胞悬浮培养技术生产药用活性成分，不仅可以解决中药野生资源和土地匮乏问题，也可以有效控制有效成分含量。利用植物细胞悬浮培养虽然能够生产天然活性成分，但是往往由于培养物中目标次生代谢产物量少而成为制约工业化应用的主要因素，常用的提高产量的方法有培养条件优化，加前体物质，添加酵母提取物、重金属、紫外线等刺激因子。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供。实现上述专利技术的技术解决方案是:，包括如下步骤，(1)单细胞的获取:选择生长旺盛的铁线莲植株叶片，消毒，放入研钵中，加入缓冲液，研磨，筛网过滤，取滤液，离心得到沉淀的单细胞；(2)初代培养:把单细胞加入到液体MS培养基中，培养基中另加入常规剂量的抗生素卡那霉素或氨苄霉素，再加入常规剂量的抗真菌农药代森锰锌或多菌灵或恶霉灵或甲基硫菌灵或氟喹唑，放入摇床中培养，培养条件:光照时间16h/d，光照强度1500-20001x，温度25 °C ±1°C，摇床转速120r/min ；(3)固体培养:将细胞悬浮培养液用筛网过滤，滤液离心处理后弃去上清液，得到单细胞悬浮液，将单细胞悬浮液与固体MS培养基混合，混合液倒入培养皿中，混合前固体MS培养基的温度为40°C ±3°C，培养皿置于培养箱中在25°C ± 1°C的条件下光照培养12d ;(4)继代培养:挑取生长良好的单细胞团接入液体MS培养基中培养，培养条件:光照时间16h/d，光照强度1500-20001x，温度25°C ±1°C，摇床转速120r/min ；(5)发酵培养:继代培养15±3天后，将培养物置于4-10°C冷处理8_12小时，再常规培养7±2天。作为进一步的技术方案，所述步骤(3)中，将单细胞悬浮液与固体MS培养基混合前，将单细胞悬浮液中的单细胞密度调整至104-105个/ml。作为再进一步的技术方案，所述步骤(3)中，单细胞悬浮液与固体MS培养基以1:1的体积比混合。本专利技术的主要有益效果有:(1)提高了细胞培养物中总黄酮的含量，相比同等条件下不进行冷处理的培养物，总黄酮的含量可以提高5倍；(2)相比通过物理方法提高次生代谢产物的途径，如紫外线照射等，本方法具有操作简便，容易实施的优点；(3)相比通过生物学方法提高高次生代谢产物的途径，如添加糖蛋白、多糖、真菌等，本方法具有成本低等优点。【具体实施方式】实施例1:，包括如下步骤，(1)单细胞的获取:选择生长旺盛的铁线莲植株叶片若干，作为外植体备用；将铁线莲叶片先用清水冲洗60分钟，剪除枝干再用蒸馏水洗3次，在酒精70%-75%消毒15-30s，无菌水冲洗3次,抗真菌农药浸泡25min,最后用无菌水冲洗5次,用无菌滤纸吸干材料表面水分；将消毒过的外植体放入研钵中，加入缓冲液，研磨数分钟，然后用61μπι不锈钢筛网过滤，弃滤渣，取滤液，得到细胞悬浮液；将悬浮液用1000 μ L移液枪吸入1.5ml规格的EP管中，在5500r/min的转速下离心20min,得到沉淀的单细胞；(2)初代培养:在超净台上用枪将单细胞加入到液体MS培养基中，培养基中另加入常规剂量的抗生素卡那霉素或氨苄霉素，每100ml液体MS培养基中加入100 μ L卡那霉素，或每100ml液体MS培养基中加入50 μ L氨苄霉素；再加入常规剂量的抗真菌农药代森锰锌或多菌灵或恶霉灵或甲基硫菌灵或氟喹唑，抗真菌农药的加入量为每100ml液体MS培养基中加入20 μ L ;之后放入摇床中培养，培养条件:光照时间16h/d,光照强度1500-20001x，温度 25 0C ±1°C，摇床转速 120r/min ；(3)固体培养:将细胞悬浮培养液用61 μ m不锈钢筛网过滤，滤液离心处理后弃去上清液，得到单细胞悬浮液，将单细胞悬浮液中的单细胞密度调整至104-105个/ml，之后将单细胞悬浮液与固体MS培养基以1:1的体积比混合，混合液倒入无菌的直径为9cm的培养皿中，水平放置，待琼脂冷却凝固后，密封皿口 ；混合前固体MS培养基的温度为400C ±3°C，培养皿置于培养箱中在25°C ±1°C的条件下光照培养12d ;(4)继代培养:挑取生长良好的单细胞团接入液体MS培养基中培养，每7天继代I次，培养条件为:光照时间16h/d，光照强度1500-20001x，温度25°C ±1°C，摇床转速120r/min ； (5)发酵培养:继代培养15±3天后，将培养物置于4-10°C冷处理8_12小时，再常规培养7±2天，之后收获细胞，提取黄酮。经检测，相比同等条件下不进行冷处理的培养物，总黄酮的含量可以提高5倍左右。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高湖州铁线莲悬浮细胞培养物中总黄酮的方法，其特征在于：包括如下步骤，（1）单细胞的获取：选择生长旺盛的铁线莲植株叶片，消毒，放入研钵中，加入缓冲液，研磨，筛网过滤，取滤液，离心得到沉淀的单细胞；（2）初代培养：把单细胞加入到液体MS培养基中，培养基中另加入常规剂量的抗生素卡那霉素或氨苄霉素，再加入常规剂量的抗真菌农药代森锰锌或多菌灵或恶霉灵或甲基硫菌灵或氟喹唑，放入摇床中培养，培养条件：光照时间16h/d，光照强度1500?2000lx，温度25℃±1℃，摇床转速120r/min；（3）固体培养：将细胞悬浮培养液用筛网过滤，滤液离心处理后弃去上清液，得到单细胞悬浮液，将单细胞悬浮液与固体MS培养基混合，混合液倒入培养皿中，混合前固体MS培养基的温度为40℃±3℃，培养皿置于培养箱中在25℃±1℃的条件下光照培养12d；（4）继代培养：挑取生长良好的单细胞团接入液体MS培养基中培养，培养条件：光照时间16h/d，光照强度1500?2000lx，温度25℃±1℃，摇床转速120r/min；（5）发酵培养：继代培养15±3天后，将培养物置于4?10℃冷处理8?12小时，再常规培养7±2天。...

【技术特征摘要】
1.一种提高湖州铁线莲悬浮细胞培养物中总黄酮的方法，其特征在于:包括如下步骤， (O单细胞的获取:选择生长旺盛的铁线莲植株叶片，消毒，放入研钵中，加入缓冲液，研磨，筛网过滤，取滤液，离心得到沉淀的单细胞； (2)初代培养:把单细胞加入到液体MS培养基中，培养基中另加入常规剂量的抗生素卡那霉素或氨苄霉素，再加入常规剂量的抗真菌农药代森锰锌或多菌灵或恶霉灵或甲基硫菌灵或氟喹唑，放入摇床中培养，培养条件:光照时间16h/d，光照强度1500-20001x，温度25 0C 土 1°C，摇床转速 120r/min ； (3)固体培养:将细胞悬浮培养液用筛网过滤，滤液离心处理后弃去上清液，得到单细胞悬浮液，将单细胞悬浮液与固体MS培养基混合，混合液倒入培养皿中，混合前固体MS培养基的温度为40°C ±3°...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱坤，周国庆，张海洋，徐秀芳，葛海霞，孙来玉，肖莉，文良柱，
申请(专利权)人：钱坤，
类型：发明
国别省市：