狼疮抗凝物的检测方法技术

本发明专利技术提供即使是来自接受华法林、肝素等抗凝血疗法的患者的试样，也不受该抗凝血疗法的影响，且能够与血液凝固因子的缺乏进行鉴别，不使用健康者血浆的简便的LA检测方法的开发。一种狼疮抗凝物的检测方法，其特征在于，包括下述工序（A）、（B）以及（C）。（A）在血液凝固时间的测定前或者测定时，分别向血液试样和该试样的稀释试样中添加含有血液凝固因子的缓冲液组合物的工序，（B）对工序（A）的各试样测定血液凝固时间的工序，（C）对在工序（B）中得到的各试样的血液凝固时间进行对比的工序。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】狼疮抗凝物的检测方法
本专利技术涉及一种在抗磷脂抗体综合征的诊断中使用的检测狼疮抗凝物阳性的方法。
技术介绍
狼疮抗凝物（LA）是首先在SLE（系统性红斑狼疮，SystemicLupusErythematosus）患者中被报告的循环抗凝血素。对于LA阳性患者而言，在临床上几乎没有确认到出血趋势，而显示血栓趋势。但是，对于来自LA阳性患者的试样而言，在体外显示活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）的延长趋势。根据其后的研究，明确了LA是针对带阴性电荷的磷脂与像β2-糖蛋白I（β2GPI）或者凝血酶原这样的血液中的蛋白质的复合体的自身抗体，现在已知对于SLE以外的疾病也大多检测出LA。特别是在被统称为“抗磷脂抗体综合征（Antiphospholipidsymdrome；APS）”的病状中发生频率高，成为其诊断基准中的检查结果之一（非专利文献1）。LA被定义为一种不阻碍每个凝血因子活性地阻碍体外磷脂依赖性的凝血反应（APTT、高岭土凝血时间、稀释拉塞尔（Russell）蛇毒时间等）的免疫球蛋白，而并非单一的抗体。例如作为LA的主要抗体的一种，发现了抗心磷脂-β2GPI复合体抗体、抗磷脂酰丝氨酸-凝血酶原复合体抗体等，存在基于ELISA法的测定体系。但是，不能否认除这些以外的LA责任抗体的存在，即使这些已知的责任抗体全部为阴性，LA也有呈阳性的情况。作为LA的检测用试剂，通常使用含有磷脂的血液凝固时间测定用试剂。如果样品中含有LA，则LA与试剂中的磷脂结合，因此进行体外的凝血反应所需的磷脂不足，血液凝固时间延长。因此，根据该血液凝固时间的延长，可以判定LA阳性。作为该LA检测用试剂的例子，有APTT、PT、以及稀释拉塞尔蛇毒时间（dRVVT）用的试剂等。另外，还进行血液凝固修正试验（以下，有时也称为“混合试验”“Mixingtext”），即，使用含有磷脂的血液凝固时间测定用试剂，向被检血浆中添加正常血浆，将其血液凝固时间被修正（正常化）的程度图表化而进行判定（非专利文献2）。作为市售的LA检测用试剂，可利用LA测试“Gradipore”（医学生物学研究所社制）之类的基于dRVVT的测定用试剂。该试剂基于由添加拉塞尔蛇毒引起的凝固时间与由添加拉塞尔蛇毒和过量浓度的磷脂引起的凝固时间之比来判定样品中的LA的有无。另外，除上述之外，还市售有STACLOTLA（DIAGNOSTICASTAGO公司制）之类的LA检测用试剂。在使用该试剂时，通过观察向被检血浆中加入正常血浆和过量磷脂时与向被检血浆中仅加入正常血浆时的APTT的凝固时间之差来判定样品中的LA的有无。但是，对于上述现有方法而言，仅仅利用各试剂测定单独的项目时，难以鉴别凝固时间的延长原因是单纯由缺乏凝血因子所致的，还是由针对凝血因子的抑制因子所致的，还是由LA所致的。另一方面，因该原因的不同而导致治疗方针不同，所以其鉴别很重要。因此，这些LA检测方法很少单独使用，推荐组合2种以上的检查，综合判断其结果（非专利文献3）。非专利文献1:INTERNATIONALCONSENSUSSTATEMENTONPRELIMINARYCLASSIFICATIONCRITERIAFORDEFINITEANTIPHOSPHOLIPIDSYNDROME，ARTHRITIS＆RHEUMATISMVol.42,No.7,July1999,pp1309-1311非专利文献2:检查与技术，Vol.34,No.8,2006年8月,pp735-742非专利文献3:Updateoftheguidelinesforlupusanticoagulantdetection,JournalofThrombosisandHaemostasis，7：pp1737-1740（2009）
技术实现思路
如上所述，为了进行LA检测，必须要组合若干种检查，很复杂，存在对于其结果的解释也需要熟练的问题。例如，在多种LA检测方法中阳性、阴性的判定不同时，需要在考虑各检测方法的原理后作出的解释，而且必须要根据各检测方法的假阴性·假阳性的可能性进行判断，非常难以用现有的LA检测方法鉴别LA的有无。另外，LA阳性患者大多呈现血栓症状，怀疑LA并开始检查时，大多已经实施抗凝血疗法。但是，对于来自实施抗凝血疗法的患者的试样而言，已知有在APTT、dRVVT中呈假阳性而在混合试验中产生假阴性的情况。作为抗凝血疗法，紧急时，可使用有速效性且能够静脉内给药的肝素、通过长期给药来预防时，可使用作为口服抗凝血药的华法林。华法林通过对维生素K的作用进行拮抗，从而抑制血液凝固因子中的第II因子（凝血酶原）、第VII因子、第IX因子、第X因子在肝脏中的生物合成。因此，对于华法林服用者而言，由于这些凝血因子的活性降低，所以与LA的有无无关地，APTT、PT、dRVVT大幅度延长。另外，在混合试验中，有时与LA的有无无关地被判定为因子缺乏型。另外，肝素由于使抗凝血酶活化，使抗凝血作用活化而抑制凝固，所以与LA的有无无关地大幅度延长凝血时间。因此，国际血栓止血学会（ISTH）推荐，在进行LA检测时，对于来自华法林给药患者的试样，为了补充不足的凝血因子，对被检血浆混合等量的健康者血浆后进行测定。对于上述健康者血浆，进行二次离心处理，以使血小板数低于107/mL，且各家自行制备所有血液凝固因子的活性几乎为100%的试样而使用（非专利文献3）。但是，在血液凝固因子中还存在活性非常不稳定且易失活的物质，所以非常难以制备这样的健康者血浆，有不易稳定获得的问题。另外，在上述健康者血浆的制备中，虽然储留（存积）、混合血浆的人数越多，越能够使凝血因子活性的每个人的波动平均化，但是因设备而导致无法确保健康者的人数，血浆提供者出现偏差，因此还存在批次间的品质产生差别的问题。进而，使用健康者血浆的方法不仅会稀释被检血浆中的LA，有时也会添加健康者血浆中所含的阻碍LA测定的物质（来自磷脂、血小板的破碎膜等），所以特别是LA呈弱阳性时，还存在可能会发生假阴性化的问题。在利用抗凝血疗法抑制血栓症状期间，该血栓症状的原因的鉴别影响治疗方针，所以很重要。另外，在最初确认LA阳性并开始抗凝血疗法时，也认为监视LA的消长是非常有用的，但是目前不存在简便地实现它的方法。因此，迫切期望开发即使是来自接受华法林、肝素等抗凝血疗法的患者的试样，也不受该抗凝血疗法的影响、且能够与血液凝固因子的缺乏进行鉴别，不使用健康者血浆的简便的LA检测方法。因此，本专利技术人为了解决上述课题进行了各种研究，结果发现，准备血液试样及其稀释试样，在该各试样的血液凝固时间的测定前或者测定时，向各试样中添加含有血液凝固因子的缓冲液组合物（以下，也称为辅助试剂），对该各试样测定血液凝固时间，只要对这些各试样的血液凝固时间进行对比，就能够不受抗凝血疗法影响地、与现有的方法相比敏感度·特异度也良好地检测LA，从而完成了本专利技术。即，本专利技术提供一种狼疮抗凝物的检测方法，其特征在于，包括以下工序（A）、（B）以及（C）。（A）在血液凝固时间的测定前或者测定时，分别向血液试样和该试样的稀释试样中添加含有血液凝固因子的缓冲液组合物的工序，（B）对工序（A）的各试样测定血液凝固时间的工序，（C）对工序（B）中得到的各本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种狼疮抗凝物的检测方法，其特征在于，包括下述工序（A）、（B）以及（C）：（A）在血液凝固时间的测定前或者测定时，分别向血液试样和该试样的稀释试样中添加含有血液凝固因子的缓冲液组合物的工序，（B）对工序（A）的各试样测定血液凝固时间的工序，（C）对在工序（B）中得到的各试样的血液凝固时间进行对比的工序。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.06.17 JP 2011-1351731.一种含有血液凝固因子的缓冲液组合物在制备狼疮抗凝物的检测试剂中的应用，其特征在于，所述狼疮抗凝物的检测试剂被用于狼疮抗凝物的检测方法，所述检测方法包括下述工序(A)、(B)以及(C)：(A)在血液凝固时间的测定前或者测定时，分别向血液试样和该试样的稀释试样中添加含有血液凝固因子的缓冲液组合物的工序，(B)对工序(A)的各试样测定血液凝固时间的工序，(C)对在工序(B)中得...

【专利技术属性】
技术研发人员：家子正裕，森川千鹤，
申请(专利权)人：学校法人东日本学园，积水医疗株式会社，
类型：
国别省市：