人GDNF的变体制造技术

本发明专利技术涉及人胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的新型变体及其使用方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】人GDNF的变体本专利技术涉及医药领域，特别是治疗性蛋白的领域。具体地，本专利技术涉及人胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的新型变体。GDNF的新型变体可用于帕金森氏病的治疗。⑶NF是公知的神经营养因子，据报道，其在体外和体内向多巴胺能神经元提供营养支持。此外，已报道，GDNF在帕金森氏病的啮齿动物和灵长类动物模型中提供功能性改善并具有神经保护作用。已将来自大肠杆菌该w7i)的野生型⑶NF蛋白经中枢给药至患有帕金森氏病的患者，并获得了混合的结果。在两个小型开放标签研究(open labeledstudies)中报道，野生型⑶NF产生了对运动功能的长期改善。然而，在34名患者的随机、安慰剂对照、IIa期试验中，⑶NF的壳内递送(intra-putamenal delivery)在6个月没有显示症状改善。生物标记物信号的增加仅明显可见于输注部位周围的近邻组织。一个近期的报道指出，GDNF可能是有望挽救垂死神经的分子；然而，将此分子递送至正确的脑区域仍是严峻的挑战(Nature, Vol 466:19，2010年8月)。 W097/11964 (PCT/US96/14915)中报道了截短的⑶NF蛋白；然而，仍需要具有期望的药理学性质、稳定性和生物-分布特性的新GDNF变体。需要变体形式的GDNF，其在递送装置中稳定，并且有利于期望的脑部生物-分布，同时展示期望的效力和可接受的免疫原性性质。提供一种或多种这些期望性质的⑶NF变体可以成为在药学上有用的新药物疗法，特别是用于帕金森氏病的治疗中。本专利技术提供了缺少N-末端的前31个氨基酸的成熟人GDNF结构域的新型截短的⑶NF变体(“ Λ 31-N-末端截短的⑶NF”)，并具有引入的某些氨基酸取代，以提供稳定、效力适合，提供期望的生物-分布特性和药学可接受的免疫原性概况的GDNF变体。本专利技术提供了给出超过成熟人野生型GDNF的一个或多个优点的人GDNF的某些变体，包括与人野生型GDNF相比，具有改进的药物稳定性，以及改进的生物分布，减少的肝素结合，减少的脱酰胺化，对琥珀酰亚胺形成的敏感性降低，以及免疫原性潜力降低的变体。某些新GDNF变体可能成为对帕金森氏病患者有用的新治疗选择。本专利技术提供了人⑶NF变体，其包含SEQ ID NO: 23: RCSQRCKQRGCVLTAIHLNWDyjLGYETKEELIFRYCSOSCDAAETTYDiaLXiiaii NLSXa%8HXai?9oRLVSEiC￥GQACCRPIAFDDDLSFLDDNL￥Y WLRXtaia3HSAKXia mCGCI (SEQ ID HO; 23),其屮i)Xaa84 是 K 或 A ;ii)Xaa88 是 R 或K;iii)Xaa9tl 是 R 或K;iv)Xaa125 是 K 或 E ;和V) Xaa13c!是 R 或 E。本专利技术进一步提供了人GDNF变体，其中，所述变体选自:RCK|10KQRGCmTAmWTDLGLGYETl:iELIfRYCSGSCDAAlTT￥DiaLICNL SRMWL￥SEKVGQACCRPIAFDDDLSFLD1>NLWHIL1IICHSAKRCGCI (SEQ ID NO:9), RGQRGICQEOCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEE^LIFilYCSOSCDAAETTYDiaLAML iICMCIILVSEiCVGQACCRWAFDDDLSFL0DNlVYHtt,llCHMI?CC3Cl (SEQ Π3 NO: 12}, IH RGQRGEQRGCVLTAIHLIWTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILANL SKNICRLVSlK￥GQACCRPiAFDDDLSFLDDNL￥YramEHSAKECGCI (SEQ ID NO: 15)。一方面，本专利技术提供了包含SEQ ID NO: 9中所示氨基酸序列的人⑶NF变体: RGQRGKQRGCVLTAIHLNWDLOLGYEmEELIFEyCSGSCDAAlTTYDICILKNL SRMRRLVSEICVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI。本专利技术进一步提供了可用于制备成熟人GDNF的Λ 31-N-末端截短的变体的中间体。所述中间体包含氨基酸序列SEQ ID NO: 23: RGQRGKQRGC￥LTAIHLN￥TDLGLG￥ETKEELIFRTCSGSCDAAETTTOmUCfliiM NLSXm轉WCaawRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILIOCetiaHSAK-- ,3eCGCI(SEQIDm 23)，其在N-末端具有分泌信号肽的延伸。本专利技术中可使用多种分泌信号肽序列。示例性的分泌信号肽序列包括具有序列METDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ IDNO: 25)的鼠 K 前导分泌信号肽，和具有序列 MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA (SEQ ID NO:32)的人生长激素分泌信号肽。具有这些分泌信号肽的中间体能够以超过具有其他前导序列的截短⑶NF构建体的提高产量产生本专利技术要求保护的人⑶NF变体。因此，所公开的包含分泌信号肽的中间体具有以下的氨基酸序列: METDTLLLW￥LLLW￥KjSTGEGQaGKQR.GCVLTAIHLN￥TDLGLG￥ETKEELIF RYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNEILVSIKVGQACCRPMFDDDLSFLDDNLW H1LKKHSAICRCGC1 (SEQ ID NO: 28);.? Matgsrt^lllafgllclpwlqegsargqiigkqrccvltaihlnvtdloUjyet KEEUFRYCSOSCDAAETTYDiaLKNLSRMlRiVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLD DMLVYfflOtKHSAKRCGCI (SEQ ID NO； 35)。本专利技术提供了药物组合物，其包含本专利技术要求保护的人GDNF的变体和一种或多种药学可接受的稀释剂、载体或赋形剂。本专利技术提供了人GDNF的变体，其作为药物使用。本专利技术进一步提供了人GDNF的变体，其用于帕金森氏病的治疗。本专利技术提供了 GDNF的变体，其用作治疗剂。[0011 ] 优选其中Xaa84是A, Xaa88是K,且Xaa9tl是K的变体。优选其中Xaa84是K，Xaa88是R，且Xaa9tl是R的变体。优选其中Xaa125是K且Xaa13tl是R的变体。优选其中Xaa84 是 A，Xaa88 是 K，且 Xaa9tl 是 K，Xaa125 是 E 且 Xaa13tl 是 E 的变体。专利技术详沭 已报道，野生型⑶NF很可能通过定位于N-末端1-31个氨基酸残基中的正电荷而结合肝素和细胞外基质，由此限制了⑶NF在递送后在脑部中的分布(Lin等}J Neurochem63，758-768，1994 ;Rickard 等人，13，419-426，2003 ;Piltonen 等人，Experimental Neurology 219, 499-506，2009)。还有报道，⑶NF在帕金森氏病的啮齿动物和灵长类动物模型中提本文档来自技高网...

【技术保护点】
人GDNF变体，其包含氨基酸序列SEQ?ID?NO:23：其中：i)?Xaa84是K或A；ii)?Xaa88是R或K；iii)?Xaa90是R或K；iv)?Xaa125是K或E；且v)?Xaa130是R或E。dest_path_image001.jpg

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.04.11 US 61/474,0241.人⑶NF变体，其包含氨基酸序列SEQID NO: 23:RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLCjtGyETKEELlFRyCSGSCDAAETTYDKILXa8*NLSXa_WCs%olLVSEKVGQACCRPlAFDDDLSFLDDNLVYHlLRXiml2SHSAIQCM,xiCOCl其中:i)Xaa84 是 K 或 A ;ii)Xaa88 是 R 或K;iii)Xaa9tl 是 R 或K;iv)Xaa125 是 K 或 E ;且V) Xaa13c!是 R 或 E。2.如权利要求1所述的人GDNF变体，其中所述变体选自以下: EGQRGKQRGCVLTAlHLNVTDLGLGYETKLEELFRYCSGSCDAA^EnriYD K,ILK.WLSRNR.RL￥SEiC￥GQACCRPIAFDDDLSFLDDNLWHILiKHSAK RCGCI (SEQ ID N0:9), RGQRGKQRC5C￥LTAIHLNVTDLGLGYEmEELIFR￥CSGSCD.AAfilTYD KILAMLSKNliRL￥SEli￥GQAC€RPIAFDDDLSFLDDNLWHEillCHSAK R€GCI (SEQ ID N0:12),和 RGQRCSKQRCCVLTAIHLNVTOLGLCiYEmifiLIFIlYCSGSCDAABrrYDKILANLSKNK1LVSEKVGQA CCRPWFDDDLSFLDDNLVYH1LREHSAK:ECGCI (SEQ ID NO: 15) o3.如权利要求2所述的人⑶NF变体，其中所述变体是: RGQRGKQRClCTLTAIHLNVTDLGLG￥ETKEEUFEyCS€5SCD...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁敦敏，吕继蓉，KM默钱特，M加尼姆，LM奥布赖恩，RC史密斯，
申请(专利权)人：伊莱利利公司，
类型：
国别省市：