本发明专利技术提供了一种循环肿瘤细胞(CTCs)的富集方法及其试剂盒。应用于从血液中快速高效富集CTCs。包括步骤：通过把抗上皮细胞粘附分子(EpCAM)抗体偶联到磁性纳米球上，制备得到免疫磁珠。将免疫磁珠投入到血液样本中孵育5min，再通过磁分选和洗涤等步骤即实现了对CTCs的分离富集和纯化，该法捕获效率高，富集时间短，特异性好，非常可靠。所捕获的细胞的活性率保持在(90.5±1.2)%，可以直接用于培养、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、以及免疫细胞化学分析。这将为CTCs的检测和研究提供有力的手段，具有极其重要的医学意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于纳米材料
。
技术介绍
癌症是当今世界人类健康和生命的最大威胁，以至于人人“谈癌色变”。而上皮来源的恶性肿瘤是最常见的一种癌症，乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、食道癌等都属于这类癌症，这类癌症带来的死亡主要是由于癌症的复发和转移造成的。近年来的研究表明，癌细胞可以从原发肿瘤组织脱落进入血液系统，成为循环肿瘤细胞(CTCs)，是癌症转移的重要中间事件，CTCs的数目与癌症病人的生存率关系极大，因此检测CTCs在医学上具有重要的意义。但是CTCs以极低浓度存在于血液中，所以检测CTCs面临的最大的困难就是浓度低环境复杂。随着科学技术的发展，人们建立了很多种检测CTCs的方法。由于CTCs浓度低，所以一般要先对CTCs进行有效的分离和纯化。其中，磁富集是应用最为广泛的一种分离技术，其操作容易，捕获效率高，应用前景好。但目前大多用微米级磁球捕获CTCs，捕获肿瘤细胞后需要经过磁球释放过程才能进行分析，这无疑使CTCs的检测和分析变得比较繁琐。只有Veridex公司开发的CellSearch系统以及MiltenyiBiotec公司开发的MACS系统是使用纳米级磁球捕获肿瘤细胞。CellSearch系统使用的是120-200 nm磁性纳米球,其在捕获细胞过程中增加了额外的步骤来增强纳米球的磁性:首先在磁性纳米球上偶联上抗上皮细胞粘附分子抗体和生物素类似物，用这种免疫磁球去捕获CTCs ;然后加入链酶亲和素与生物素类似物结合；再加入过量的磁球与SA结合，这样增大了磁球的体积，使磁响应变快从而使磁分选容易进行；经过分离和洗涤等步骤后，加入生物素，由于其与链酶亲和素的结合能力强于生物素类似物，可以把链酶亲和素竞争的结合下来，从而释放多余的磁球。这种方法为CTCs的捕获引入了很多步骤，操作比较繁琐。而MACS系统使用的是50 nm的磁性纳米球，磁响应较慢，需要强磁性的磁分离工具——磁分离柱(MACS Columns和MACSSeparator)才能完成分选,这不方便普通用户。所以开发一种磁响应迅速，用普通磁铁就可以完成磁分选，且处于纳米尺寸，用其捕获CTCs后不用经过磁球释放可直接用于后续分析和检测的磁球，将为CTCs的研究提供更有力的手段。
技术实现思路
本专利技术所要解决的问题在于制备一种处于纳米尺寸且响应迅速的磁球并提供一种快速、高效捕获循环肿瘤细胞(CTCs)的方法及其试剂盒，为CTCs的检测、分析、研究提供有力的手段。具体的技术方案是: 利用层层组装法制备380 nm磁性纳米球，并将抗上皮细胞粘附分子抗体共价偶联到磁性纳米球表面，制备得到免疫磁球； 将免疫磁球加入到待检样品中，37° C孵育5 min,磁分选并用I XPBS缓冲溶液洗涤，即实现了对循环肿瘤细胞的分离和富集。所述免疫磁球是按照下面方法制备的:首先以苯乙烯-丙烯酰胺共聚纳米球为模板，在其表面层层组装油溶性的磁性纳米粒子nano- y -Fe2O3,组装五层后，再在其表面包被SiO2，之后经过丁二酸酐化在纳米球表面引入羧基，再通过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化磁球表面的羧基，然后与抗体上的氨基共价偶联。免疫磁球粒径约为380 nm,处于纳米尺寸,饱和磁化强度大于30 emu/g,磁响应迅速，置于磁力架上吸附I min，绝大部分磁球即可被捕获。所述待检样品为患有上皮组织来源恶性肿瘤的病人的外周血样品。本专利技术方法捕获的细胞，无需进行磁球释放，即可以采用免疫细胞化学进行鉴定，也可以直接用于培养、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。对捕获的细胞进行免疫细胞染色鉴定过程如下:①向捕获的细胞中，加入4%多聚甲醛溶液重悬细胞并在37° C下孵育10 min，固定细胞；②磁分选后加入0.1%曲通X-100 (Triton-X 100)溶液重悬细胞并在37° C下孵育10 min，通透细胞。③磁分选后加入1%牛血清白蛋白(BSA)溶液重悬细胞并在37° C下孵育30 min，封闭细胞。④磁分选加入30 yg/mL DAPI核染料溶液重悬细胞。再加入FITC标记的抗角蛋白(CK19)抗体、别藻蓝素(APC)标记的抗白细胞共同抗原(⑶45)抗体，在37° C下孵育30 min，进行免疫细胞染色。⑤磁分选并用I XPBS缓冲溶液洗涤三次，重悬于50 μ LlXPBS缓冲溶液中。并将细胞悬液置于聚二甲基硅氧烷(PDMS)小室中，用磁铁将其吸至小室底部，然后利用共聚焦荧光显微镜对细胞进行观察和鉴定。PDMS小室是这样制作的，首先在PDMS上打约6 mm的孔，然后将其键合到盖玻片上。本专利技术方法捕获的细胞，也可以直接用于培养。培养捕获的细胞过程如下:将捕获的细胞用DMEM培养基(其中含有10%胎牛血清、60 μ g/mL青霉素、100 μ g/mL链霉素溶液)，于37° C 5% CO2的细胞培养箱中培养。本专利技术方法捕获的细胞也可以直接用于逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，对捕获的细胞进行RT-PCR分析。具体可为对人的角蛋白(CK19)和表皮生长因子受体(EGFR)基因进行RT-PCR分析，但不应理解为只局限于这两种基因的分析。本专利技术还提供一种循环肿瘤细胞的富集试剂盒。所述试剂盒包括免疫磁球、I XPBS缓冲溶液、离心管和EDTA抗凝真空采血管。所述试剂盒的使用方法是:利用EDTA抗凝真空采血管收集血样，将免疫磁球与血样在37° C下孵育5 min，然后用磁力架进行磁分选并用IXPBS缓冲溶液洗涤，则循环肿瘤细胞得以富集和纯化。本专利技术方法制备了处于纳米尺寸且磁响应迅速的纳米球，并在其上偶联上抗上皮细胞粘附分子的抗体。制得的免疫磁球可以直接用于患上皮来源肿瘤的病人的血液样本，由于其尺寸小，所以具有较快的反应动力学特征，可以在5 min内即可实现对循环肿瘤细胞的快速高效捕获和富集。该法操作简便省时、富集效果好、特异性强、重现性好、非常可靠。而且纳米磁球对所捕获细胞的影响较小，捕获的细胞可以直接进行免疫染色鉴定，培养、RT-PCR等，从而实现对循环肿瘤细胞的分析研究和灵敏检测。【附图说明】图1为磁性纳米球的制备及生物功能化的示意图。图2为免疫磁球对循环肿瘤细胞的富集及鉴定分析示意图。图3为磁性纳米球的表征结果:A磁性纳米球的透射电镜图；B磁性纳米球的磁滞回线图；C利用磁力架吸附不同时间后的磁性纳米球的捕获率；D磁性纳米球的显微镜图片；E磁性纳米球与血液孵育一段时间的后的显微镜图片。图4为免疫磁球对极低浓度肿瘤细胞的捕获情况:A免疫磁球在不同环境中对SK-BR-3细胞的捕获情况(肿瘤细胞的浓度为5-300个/mL):1 XPBS体系(□)，混合细胞体系(背景细胞为Jurkat T细胞，浓度为10 6个/mL) (.),经过红细胞裂解处理后的血液(▲)，未经处理的全血(▼) ;B不同孵育时间下免疫磁球对SK-BR-3细胞的捕获情况(肿瘤细胞的浓度约为100个/mL) ；C免疫磁球对混在全血中的SK-BR-3、HuH-7、H印G2、MCF-7细胞的捕获情况。图5 A为用钙黄绿素乙酰甲酯(Calcein AM)和碘化丙啶(PI)对捕获的肿瘤细胞染色后的荧光显微镜图片；B-E依次为被本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种循环肿瘤细胞的富集方法，其特征在于：利用层层组装法制备380nm磁性纳米球，并将抗上皮细胞粘附分子抗体共价偶联到磁性纳米球表面，制备得到免疫磁球；将免疫磁球加入到待检样品中，37°C孵育5?min，磁分选并用1×PBS缓冲溶液洗涤，即实现了对循环肿瘤细胞的分离和富集。
【技术特征摘要】
1.一种循环肿瘤细胞的富集方法，其特征在于: 利用层层组装法制备380nm磁性纳米球，并将抗上皮细胞粘附分子抗体共价偶联到磁性纳米球表面，制备得到免疫磁球； 将免疫磁球加入到待检样品中，37° C孵育5 min，磁分选并用IXPBS缓冲溶液洗涤，即实现了对循环肿瘤细胞的分离和富集。2.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于，所述的将抗上皮细胞粘附分子抗体共价偶联到磁性纳米球表面，具体为通过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺活化磁球表面的羧基，然后与抗体上的氨基共价偶联。3.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于，所述免疫磁球是按照下面方法制备的:首先以苯乙烯-丙烯酰胺共聚纳米球为模板，在其表面层层组装油溶性的磁...
【专利技术属性】
技术研发人员：庞代文，温聪颖，吴玲玲，张志凌，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：
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