一种新型高度敏感的细胞内潜伏的人巨细胞病毒检测方法技术

本发明专利技术提供一种新型、高度敏感的人巨细胞病毒检测方法，此方法是提取人外周血单个核细胞的核酸，使用特异性外侧上下游引物进行第一轮PCR扩增，以第一轮的扩增产物为模板，使用特异性内侧上下游引物进行第二轮定量PCR扩增的巢式定量PCR技术，不但可检测游离的人巨细胞病毒，而且可检测细胞内感染的人巨细胞病毒。使用本发明专利技术检测HCMV的灵敏度可以达到8copies/μl。本发明专利技术应用PCR方法检测HCMV病毒潜伏感染的方法较ELISA方法具有快速简便、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，为临床提供一种早发现、早诊断的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医学和微生物学检测领域，尤其涉及一种新型、高度敏感的细胞内潜伏的人巨细胞病毒检测方法，可以在临床检验及相关研究中应用。
技术介绍
人类巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)属疱疫病毒科β属双链线性DNA病毒，具广泛细胞亲嗜性，能感染上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、外周血单个核细胞及神经细胞等。人群HCMV人群感染十分普遍，90%以上的成年人都感染HCMV，绝大多数属于无症状感染。但新生儿宫内感染或围产期感染，常造成流产、死胎、胎儿畸形、发育迟缓、听力障碍、神经系统发育迟缓等。潜伏感染是HCMV重要生物学特征，一旦感染即可终生存在人体内。由于机体生理或病理状态变化，潜伏体内的HCMV可反复激活，进入增殖性感染阶段，对免疫力低下个体(如组织器官移植个体或艾滋病患者等)可严重威胁生命。因此建立一种高度敏感特异的细胞内潜伏的人巨细胞病毒检测方法至关重要。目前对于人巨细胞病毒(HCMV)的检测方法主要有病毒分离、ΡΡ65抗原检测、血清IgM, IgG抗体检测、核酸检测等方法。HCMV诊断的金标准是HCMV分离培养，但是HCMV在体外人成纤维本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高度敏感的细胞内潜伏感染的人巨细胞病毒（human?cytomegalovirus，以下缩写为HCMV）检测方法，其特征在于：提取人外周血单个核细胞中的核酸，使用特异性外侧上下游引物进行第一轮PCR扩增，以第一轮的扩增产物为模板，使用特异性内侧上下游引物进行第二轮定量PCR扩增，以提高检测的敏感性及特异性。

【技术特征摘要】
1.一种高度敏感的细胞内潜伏感染的人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,以下缩写为HCMV)检测方法，其特征在于:提取人外周血单个核细胞中的核酸，使用特异性外侧上下游引物进行第一轮PCR扩增，以第一轮的扩增产物为模板，使用特异性内侧上下游引物进行第二轮定量PCR扩增，以提高检测的敏感性及特异性。2.如权利要求1所述的新型高度敏感的检测方法，其特征在于:其中前期样品中的核酸来自HCMV的UL138基因，可以是抽提的mRNA逆转录成的cDNA，也可以是抽提的DNA。3.如权利要求1所述的新型高度敏感的检测方法，其特征在于:其中用于人巨细胞病毒核酸检测的内外侧引物序列分别为以下编号所示的序列或至少包含这些序列10个连续性碱基构成的寡核苷酸: 外侧上游引物:5’ -ATGGACGATCTGCCGCTGAA-3’(Seq N0.1) 外侧下游引物:5’ -TCACGTGTATTCTTGATGAT-3’(Seq N0.2) 内侧上游引物:5 ’ -GCTTACCACTGGCACGACACCT-3，(Seq N0.3) 内侧下游引物:5 ’ -TACTCCCCGTACAGCTCGCAAC-3，(Seq N0.4 )。4.如权利要求1所述的新型高度敏感的检测方法，其特征在于:其中第一轮PCR的反应体系是:10 XPCR缓冲液2.5 μ L, ...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛向阳，陈静，张丽芳，陈文静，叶璐璐，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：