检测主要亚型禽白血病病毒的LAMP试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测主要亚型禽白血病病毒的LAMP试剂盒，采用环介导等温扩增（LAMP）技术，并根据根据禽白血病病毒POL基因序列设计了两对特异性引物（内引物FIP和BIP、外引物F3和B3）。应用本发明专利技术及其建立的检测方法，利用ＬＡＭＰ实时浊度仪对ＡＬＶＬＡＭＰ反应引物、反应体系及反应进程进行实时、定量、全程密闭监控分析，实现了高效、特异性扩增ＡＬＶ的ＬＡＭＰ引物。本发明专利技术具有特异性强、灵敏度高、迅速得出结果、不造成污染、可实时检测产物等优点，只需按建立的体系加样即可实时检测出禽白血病病毒，快速准确的获得检测结果，为简便、快速地检测禽白血病病毒带来便利。

【技术实现步骤摘要】
检测主要亚型禽白血病病毒的LAMP试剂盒
本专利技术属于禽白血病病毒检测
，尤其涉及一种检测主要亚型禽白血病病毒的LAMP试剂盒。
技术介绍
禽白血病病毒(ALV)根据其宿主范围、不同亚型的干扰情况及其囊膜中和抗原特性，可将其分为A到JlO个亚型，鸡群中常见为A、B、J和E亚型。禽白血病自在中国出现并流行以来，一直受到临床兽医、养殖业者以及科研人员的高度关注，在现实生产中急需该病的普查及净化的技术手段。虽然目前有检测ALV的多种方法报道，如酶联免疫吸附试验(EL I S A)、免疫组化等，检测核酸的有定量竞争P C R、原位P CR,RT-PC R等，然而传统PCR检测需要经过变性一退火一延伸，加上DNA提取整个过程大概需要2-4小时才能得出结果。这些方法在成本、灵敏度、操作方便性上存有缺陷，一定程度上限制了它们在生产中的实际应用。L A M P作为一种新的核酸扩增技术，较其它分子生物学检测方法而言具有试验条件低、灵敏度高和特异性强等优势，在医学微生物的检测中受到亲睐并推广应用。尽管如此，以往技术中所用的LAMP方法检测仍需要I小时后加入染料才能判断结果，反应中加入的突光染料syber-green,需采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像,存在开盖跑电泳观察造成的气溶胶污染，缺乏对反应的实时监控很难排除这些干扰因素，不能对检测结果做出准确的判定。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种特异性强、敏感性高、简便快速的检测主要亚型禽白血病病毒的LAMP试剂盒，以便于基层实时、快速、准确地检测禽白血病病毒。·为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案:检测主要亚型禽白血病病毒的LAMP试剂盒，该试剂盒含有以下试剂:2X反应缓冲液、引物、Bst DNA聚合酶、荧光目视检测试剂、禽白血病病毒阳性模板和超纯水；引物包括内引物FIP和BIP、外引物F3和B3，内引物FIP 的序列为 CTACATTAGTGGGCGCTGTCGGAACAACTGGAAGCACGCG，内引物BIP 的序列为 TCAAGATGGGACAGGAGGGAGITTTGGCTTAACGCATCCTCT ；外引物F3 的序列为 TGAITTGGGGGCAAGTGTAC ；外引物B3 的序列为 ATGACTCCGCACGTGGAG。该试剂盒每剂含有2X反应缓冲液12.5μ 1、引物FIP和BIP各40pmol、引物F3和B3各5pmol、BSt DNA聚合酶I μ 1、荧光目视检测试剂0.2 μ I和禽白血病病毒阳性模板2μ I。2Χ反应缓冲液来自10pamp脱氧核糖核酸扩增试剂盒；荧光目视检测试剂采用钙黄绿素突光染料，来自10pamp突光目视检测试剂盒。本专利技术采用环介导等温扩增(LAMP)技术，并根据禽白血病病毒POL基因序列设计了两对特异性引物(内引物FIP和BIP、外引物F3和B3)，由此专利技术了检测主要亚型禽白血病病毒(禽白血病病毒ALV的主要亚型A、B、E、J)的LAMP试剂盒。本专利技术提供的LAMP试剂盒及其检测方法，利用LAMP实时浊度仪对A L V L AM P反应引物、反应体系及反应进程进行实时、定量、全程密闭监控分析，实现了高效、特异性扩增A L V的L A M P引物，建立了可视化的检测禽白血病的LAMP方法，它只能从禽白血病阳性样本中进行核酸的特异性扩增，不与其它常见家禽病原发生非特异性反应。应用本专利技术只需按建立的体系加样即可实时检测出禽白血病病毒，快速准确的获得检测结果，为简便、快速地检测禽白血病病毒带来便利。与传统检测手段相比，本专利技术具有以下优点: 〈1>特异性强——所检测的阴性对照株均无阳性结果出来，与PCR检测结果一致。〈2>灵敏度高——普通PCR检测方法的灵敏度为IO3Copies/μ L数量级，而本专利技术检测限约为20copies/yL，是普通PCR的100倍左右。<3>迅速得出结果——普通PCR整个过程在2-4小时左右才能得出结果，一般LAMP方法也要I小时，本专利技术提供的检测方法反应在25-35min间即出现扩增。〈4>不造成污染——用于观察的荧光染料为反应前加入，加入的商用染料钙黄绿素(来自10pamp突光目视检测试剂盒,非syber-green),且检测过程无需开盖。〈5>可实时检测产物-利用Tubidimeter real-time LA-320池度仪可实时分析LAMP反应的结果，达到实时监测判断产物的目的。【附图说明】图1是本专利技术LAMP检测方法的特异性检测结果，图中:1ALV-A，2ALV-B，3ALV-E,4ALV-J,5MDV,6REV,7AILT。图2是本专利技术LAMP检测方法的敏感性检测结果，图中:12X 10°copies/μ L，22 XIO1Copies/μ L,32 XIO2Copies/μ L,42 XIO3Copies/μ L,52 XIO4Copies/μ L,62 X IO5Copies/ μ L, 72 X IO6Copies/ μ L, 82 X IO7Copies/ μ L。图3是本专利技术LAMP检测方法的荧光可视化检测结果，图中:左管为以禽白血病病毒为模板的反应情况，右管为阴性对照。【具体实施方式】1、材料的准备禽白血病病毒A亚型、B亚型、E亚型、J亚型均为为广西大学禽病室保存。LAMP法DNA扩增试剂盒(10pamp脱氧核糖核酸扩增试剂盒)购自北京蓝谱生物科技有限公司。2、LAMP弓丨物的设计与合成根据GenBank中禽白血病病毒POL基因序列，利用LAMP法引物辅助设计软件PrimerExplorer V4软件设计得一套LAMP引物，其中F3/B3为外引物，FIP/BIP为内引物，具体如下:内引物FIP 的序列为 CTACATTAGTGGGCGCTGTCGGAACAACTGGAAGCACGCG (见序列表SEQ.1D.N0.1),内引物BIP 的序列为 TCAAGATGGGACAGGAGGGAGITTTGGCTTAACGCATCCTCT(见序列表SEQ.1D.N0.2)；外引物F3 的序列为 TGAITTGGGGGCAAGTGTAC (见序列表 SEQ.1D.N0.3)；外引物B3 的序列为 ATGACTCCGCACGTGGAG (见序列表 SEQ.1D.N0.4)。3、病毒的DNA提取取待检病毒液或研磨好的病料，12000rpm离心2min，吸取上清100 μ L后，按基因组DNA提取试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司，Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒)说明书提取模板DNA。4、LAMP反应体系建立及具体操作步骤参考DNA扩增试剂盒说明书，按25 μ I体系配置:本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测主要亚型禽白血病病毒的LAMP试剂盒，其特征在于该试剂盒含有以下试剂：2×反应缓冲液、引物、Bst?DNA聚合酶、荧光目视检测试剂、禽白血病病毒阳性模板和超纯水；所述引物包括内引物FIP和BIP、外引物F3和B3，内引物FIP的序列为CTACATTAGTGGGCGCTGTCGGAACAACTGGAAGCACGCG，内引物BIP的序列为TCAAGATGGGACAGGAGGGAGTTTTGGCTTAACGCATCCTCT；外引物F3的序列为TGATTTGGGGGCAAGTGTAC；外引物B3的序列为ATGACTCCGCACGTGGAG。

【技术特征摘要】
1.一种检测主要亚型禽白血病病毒的LAMP试剂盒，其特征在于该试剂盒含有以下试剂: 2X反应缓冲液、引物、Bst DNA聚合酶、荧光目视检测试剂、禽白血病病毒阳性模板和超纯水；所述引物包括内引物FIP和BIP、外引物F3和B3， 内引物 FIP 的序列为 CTACATTAGTGGGCGCTGTCGGAACAACTGGAAGCACGCG， 内引物 BIP 的序列为 TCAAGATGGGACAGGAGGGAGITTTGGCTTAACGCATCCTCT ； 外引物 F3 的序列为 TGAITTGGGGGCAAGTGTAC ； 外...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦平，彭昊，韦天超，磨美兰，吴元俊，秦丽莉，石梦霞，毕玉彧，宋丽丽，王培坤，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：