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具有蛋白酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸制造技术

技术编号:9741457 阅读:78 留言:0更新日期:2014-03-07 03:40
本发明专利技术涉及具有蛋白酶活性的分离多肽和编码所述多肽的分离多核苷酸。本发明专利技术还涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞以及产生和使用这些多肽的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有蛋白酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸序列表的引用本申请含有计算机可读取形式的序列表,所述序列表通过引用的方式结合在此。专利技术背景专利
本专利技术涉及具有蛋白酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本专利技术还涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞以及产生和使用这些多肽的方法。相关技术说明本专利技术提供了具有蛋白酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。洗涤剂工业已经在洗涤剂制剂中应用不同的酶超过30年,最常使用的酶包括各自适应于去除各种类型污溃的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶。除了酶之外,洗涤剂组合物典型地包括复杂的成分组合。例如,大部分清洁产品包括表面活性剂系统、漂白剂或助洗剂。尽管当前洗涤剂复 杂,但是仍需要开发包含新酶和/或酶掺混物的新洗涤剂组合物。传统上,在升高的温度进行洗涤并且选择熟知的洗涤剂在较高温度(典型地在40°C -60°C的范围内)进行洗涤。关注于改善洗涤过程以便使得它们更为环境友好的增加导致全球范围内倾向于降低洗涤时间、PH和温度、减少可能负面地影响环境的洗涤剂组分的量。因此存在着在较低温度洗涤的需求以及因此对于在低温具有高性能的洗涤剂蛋白酶的需要。本专利技术涉及这些和其他重要目的。专利技术简述本专利技术涉及具有蛋白酶活性的分离多肽,所述分离多肽选自由以下多肽组成的组:(a)与SEQ ID NO: 2或4的成熟多肽具有至少60%序列一致性的多肽;(b)由多核苷酸编码的多肽,所述多核苷酸在中等-高严格性条件下与(i)SEQ IDNO:1或3的成熟多肽编码序列、(ii)SEQ ID NO:1或3的成熟多肽编码序列,或(iii) (i)或(ii)的全长互补链杂交;(c)由多核苷酸编码的多肽,所述多核苷酸与SEQ ID NO:1或3的成熟多肽编码序列具有至少60%序列一致性;(d)包含SEQ ID N0:2或4的成熟多肽的一个或多个(几个)氨基酸的置换、缺失和/或插入的变体;和(e)具有蛋白酶活性的(a)、(b)、(c)或(d)多肽的片段。本专利技术还涉及分离多肽,所述分离多肽包含选自下组的催化结构域,该组由以下各项组成:(a)与SEQ ID NO: 2的氨基酸150至413具有至少60%序列一致性的催化结构域(b)由多核苷酸编码的催化结构域,所述多核苷酸在中等严格性条件下与(i)SEQID NO:1的核苷酸729至1520、(ii)编码SEQ ID NO:1的催化结构域的cDNA序列,或(iii)(i)或(ii)的全长互补链杂交;(c)由多核苷酸编码的催化结构域,所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的催化结构域具有至少60%序列一致性;(d)催化结构域的变体,所述催化结构域包含SEQ ID NO: 2的催化结构域的一个或多个(几个)氨基酸的置换、缺失和/或插入;和(e)具有蛋白酶活性的(a)、(b)、(c)或(d)的催化结构域片段。在另一个实施例中,本专利技术涉及具有蛋白酶活性的分离多肽,所述分离多肽包含以下基序:His Gly Thr(Xaa)6Ala Ser Tyr Gly Ser Val Ser Gly(SEQ ID NO: 13)其中Xaa是任何天然氨基酸并且(Xaa)6意指6个连续氨基酸,其中每个氨基酸可以是任何天然氨基酸或在所述基序内的最后8个氨基酸当中包含一个或两个置换的相应基序。本专利技术还涉及包含本专利技术多肽的组合物,特别是包含本专利技术蛋白酶的洗涤剂组合物,如用于衣物或用于手工或自动洗碗的洗涤剂组合物。本专利技术还涉及使用包含本专利技术多肽的组合物洗涤纺织品的方法并且涉及用于清洁硬质表面的方法。本专利技术还涉及编码信号肽的多核苷酸,所述信号肽包含SEQ ID N0:2的氨基酸-26至-1或SEQ ID NO:4的氨基酸-160至-132或由其组成、编码前肽的多核苷酸,所述前肽包含SEQ ID NO: 2的氨基酸I至143或SEQ ID NO:4的氨基酸-131至-1或由其组成或编码信号肽和前肽的多核苷酸,所述信号肽和前肽分别包含SEQ ID NO: 2的氨基酸-26至-1及I至143或SEQ ID NO:4的氨基酸-160至-132及-131至-1或由其组成,所述多核苷酸的每一种与编码蛋白质的基因可操作地连接;涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、表达载体和重组宿主细胞;并且涉及产生蛋白质的方法。序列表概述SEQ ID NO:1是从芽孢杆菌物种(Bacillus sp.)NN018132分离的S8蛋白酶的DNA序列。SEQ ID NO: 2是如从SEQ ID NO:1推导的氨基酸序列。SEQ ID NO: 3 是从 Bacillus borgouniensis 分离的 S8 蛋白酶的 DNA 序列SEQ ID NO:4是如从SEQ ID NO:3推导的氨基酸序列。SEQ ID N0:5是来自具有登录号EMBL:GQ891986的树形类芽孢杆菌(Paenibacillus dendritiformis)的 S8 蛋白酶的 DNA 序列。SEQ ID N0:6是具有登录号SWISSPR0T:D0EVD2的树形类芽孢杆菌蛋白酶的氨基酸公开序列。 SEQ ID NO:7和8是用于扩增芽孢杆菌物种NN018132的引物SEQ ID N0:9 和 10 是用于扩增 Bacillus borgouniensis 的引物SEQ ID NO: 11是芽孢杆菌物种NN018132的融合片段SEQ ID NO: 12 是 Bacillus borgouniensis 的融合片段SEQ ID NO: 13 至 SEQ ID NO:49 是基序序列。定义蛋白酶活性:术语“蛋白酶活性”意指通过水解多肽链中将氨基酸连接在一起的肽键而催化酰胺键或蛋白质水解的蛋白酶解活性(EC3.4.21.)。用于确定蛋白酶活性的几种测定法是本领域可获得的。出于本专利技术的目的,可以使用Protazyme AK片(交联和染色的酪蛋白;来自Megazyme)或在Suc-AAPF-pNA测定法中确定蛋白酶活性,如本申请的实例部分中所述。 本专利技术的多肽具有SEQ ID NO: 2或4的成熟多肽的至少20%,例如至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%和至少100%的蛋白酶活性。分离多肽:术语“分离多肽”意指相对于如在自然界中发现的这种多肽的通过人工修饰的多肽,由此它已经完全或部分地与在自然界中与该多肽一起发现的至少一种其他化合物分离。在一个方面,该多肽是至少1%纯的,例如至少5%纯的,至少10%纯的,至少20%纯的,至少40%纯的,至少60%纯的,至少80%纯的,并且至少90%纯的,如通过SDS-PAGE所测定。分离的:术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境下的物质。分离的物质的非限制性实例包括(I)任何非天然存在的物质,(2)下述任何物质,包括但不限于任何酶、变异核酸、蛋白质、肽或辅因子,其中所述物质至少部分地从在自然界中与该物质结合的一种或多种或所有天然存在的组分移除;(3)相对于在自然界中发现的这种物质被人工修饰的任何物质;或(4)下述任何物质,其中相对于与该物质天然结合的其他组分,通过增加该物质的量修饰所述物质(例如,编码该物质的基因的多个拷贝;使用比与编码该物质的基因天然结合的启动子更强的启动子)。基本上本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有蛋白酶活性的分离多肽,所述分离多肽选自由以下多肽组成的组:(a)与SEQ?ID?NO:2或4的成熟多肽具有至少60%、例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、和100%序列一致性的多肽;(b)由多核苷酸编码的多肽,所述多核苷酸在中等严格性条件、中等?高严格性条件、高严格性条件或极高严格性条件下与(i)SEQ?ID?NO:1或3的成熟多肽编码序列、(ii)包含SEQ?ID?NO:1或3的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列,或(iii)(i)或(ii)的全长互补链杂交;(c)由多核苷酸编码的多肽,所述多核苷酸与SEQ?ID?NO:1或3的成熟多肽编码序列具有至少60%、例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少85%、至少90%、和至少95%序列一致性;(d)包含SEQ?ID?NO:2或4的成熟多肽的一个或多个(几个)氨基酸的置换、缺失和/或插入的变体;(e)具有蛋白酶活性的(a)、(b)、(c)或(d)多肽的片段;和(f)具有蛋白酶活性并且进一步包含以下基序的多肽:His?Gly?Thr(Xaa)6Ala?Ser?Tyr?Gly?Ser?Val?Ser?Gly(SEQ?ID?NO:13)其中Xaa是任何天然氨基酸并且(Xaa)6意指6个连续氨基酸,其中每个氨基酸可以是任何天然氨基酸;或在所述基序如选自SEQ?ID?NO:14至SEQ?ID?NO:49的基序内的最后8个氨基酸当中包含一个或两个置换的相应基序。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.06.24 EP 11171317.81.一种具有蛋白酶活性的分离多肽,所述分离多肽选自由以下多肽组成的组: (a)与SEQID N0:2或4的成熟多肽具有至少60%、例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、和100%序列一致性的多肽; (b)由多核苷酸编码的多肽,所述多核苷酸在中等严格性条件、中等-高严格性条件、高严格性条件或极高严格性条件下与(i)SEQ ID NO:l或3的成熟多肽编码序列、(ii)包含SEQ ID NO:l或3的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列,或(iii)⑴或(ii)的全长互补链杂交; (c)由多核苷酸编码的多肽,所述多核苷酸与SEQID NO:1或3的成熟多肽编码序列具有至少60%、例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少85%、至少90%、和至少95%序列一致性; (d)包含SEQID NO:2或4的成熟多肽的一个或多个(几个)氨基酸的置换、缺失和/或插入的变体; (e)具有蛋白酶活性的(a)、(b)、(C)或(d)多肽的片段;和 (f)具有蛋白酶活性并且进一步包含以下基序的多肽:His Gly Thr(Xaa)6Ala Ser Tyr Gly Ser Val Ser Gly (SEQ ID NO: 13) 其中Xaa是任何天然氨基酸并且(Xaa) 6意指6个连续氨基酸,其中每个氨基酸可以是任何天然氨基酸; 或在所述基序如选自SEQ ID N0:14至SEQ ID NO:49的基序内的最后8个氨基酸当中包含一个或两个置换的相应基序。`2.如权利要求1所述的多肽,所述多肽与SEQID NO:2或4的成熟多肽具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性。3.如权利要求1或2所述的多肽,所述多肽由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格性条件、低-中等严格性条件、中等严格性条件、中等-高严格性条件、高严格性条件或极高严格性条件下与(i)SEQ ID NO:l或3的成熟多肽编码序列、(ii)包含SEQ ID NO:l或3的成熟多肽编码序列的基因组DNA,或(iii)⑴或(ii)的全长互补链杂交。4.如权利要求1-3中任一项所述的多肽,所述多肽由多核苷酸编码,所述多核苷酸与SEQ ID NO:1或3的成熟多肽编码序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性。5.如权利要求1-4中任一项所述的多肽,所述多肽包含SEQID NO:2或4或由其组成。6.如权利要求1-5中任一项所述的多肽,所述多肽包含SEQID NO:2或4的成熟多肽或由其组成。7.如权利要求6所述的多肽,其中该成熟多肽是SEQID NO: 2的氨基酸144至418或...

【专利技术属性】
技术研发人员:MS伯彻特JW塔姆斯
申请(专利权)人:诺维信公司
类型:
国别省市:

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