一种靶向FoxQ1基因的干扰siRNA及其抗非小细胞肺癌的用途制造技术

本发明专利技术公开了一种靶向FoxQ1基因干扰siRNA及其应用，所述siRNA的序列为：正义链：5′-GCCAAGCAAUUUCUUUAAATT-3′，反义链：5′-UUUAAAGAAAUUGCU?UGGCTT-3′。本发明专利技术运用荧光定量RT-PCR、Western?Blot、CCK8法、Transwell小室模型、流式细胞术等现代分子生物学技术，成功构建出靶向FoxQ1基因干扰siRNA，通过在细胞水平和动物水平研究干扰FoxQ1基因后对肺癌细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡及化疗敏感性的影响，及对裸鼠成瘤能力的抑制作用，确定以FoxQ1作为靶点治疗肺癌的可能性和协助化疗治疗肿瘤的作用，该siRNA在特异性地沉默FoxQ1基因中的具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
—种靶向FoxQI基因的干扰siRNA及其抗非小细胞肺癌的用途
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种靶向FoxQl基因的干扰siRNA及其抗非小细胞肺癌的用途。
技术介绍
肺癌是当今世界上发生率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，每年世界上约有135万人被诊断为肺癌，近年来，肺癌引起的死亡人数已超过乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌等，成为癌症死亡的首要原因。其中非小细胞肺癌(NSCLC)是最常见的肺癌类型，相当多的患者属于对传统治疗无效的难治性肺癌。尽管近年来多学科综合治疗模式的进展使得非小细胞肺癌的治疗效果有了较大的提高，但由于转移和耐药等原因，目前死亡率仍然很高，总的五年生存率仅15%左右。因此迫切需要寻求新的诊断指标和加强综合治疗，探索新的治疗策略及治疗靶点，成为肺癌研究最受关注的领域之一。肿瘤的发生发展是一个多阶段、多步骤、多基因参与的病理过程，涉及到原癌基因的激活、抑癌基因的失活以及凋亡相关基因的异常表达，在本质上是一种多基因异常的疾病。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是目前日趋发展和逐渐成熟的一门新兴的基因沉默技术，是内源性或外源性双链RNA(double strand ed RNA, dsRNA)在基因的转录后水平上，介导细胞内mRNA发生特异性降解，导致靶基因表达沉默，从而产生相应功能表型的缺失，是特异性抑制具有与dsRNA同源序列的基因的表达的过程，属序列特异性的转录后基因沉默，具有高效性、特异性、位置效应、竞争效应和可传播性的特点。大量研究表明，RNAi是广泛存在于生物界的古老现象，不同的有机体，包括植物、果蝇、线虫及一些哺乳动物细胞中都存在RNAi现象。RNAi在生物进化上是保守的，是生物体抵御病毒或其他外来核酸入侵以及保持自身遗传稳定的保护性机制，是包括人类在内的从低等真核生物到哺乳动物体内天然存在的基因沉默机制，其抑制靶基因表达的效率远比反义核酸高，持续时间也更长。在不影响正常基因功能的前提下，RNA干扰可以抑制某些癌变过程中的重要基因的突变或过量表达，从而达到基因治疗的目的。随着RNA干扰技术的不断完善，针对各种恶性肿瘤的RNAi已经取得了肯定的效果。RNAi现象的发现为基因治疗研究提供了强有力的工具。siRNA对靶基因的抑制效率明显高于反义核酸，与反义核酸相比，siRNA用量更低，并且克服了反义核酸的一些缺点，如寡聚物的非特异性结合、易降解等。化学合成的siRN能快速转入细胞中并且发生作用，与此同时，化学合成的siRNA费用高，容易降解，仅瞬时表达，且其左右只能持续一周时间。不利于进一步长期稳定的进行机理研究 。Forkhead(Fox)转录因子家族成员通过招募共激活因子调苄基因转录，参与细胞生长、分化、凋亡、迁移等多种生物学过程，其突变和表达异常与发育畸形、代谢性疾病以及肿瘤发生有关。FoxQl是Fox转录因子家族较新的成员之一，位于人类染色体6p23-25，早期研究发现FoxQl与毛囊发育及细胞分化有关；现已被证实在人类某些恶性肿瘤发生发展中扮演着非常重要的角色。另外，FoxQl受转化生长因子-0 (transforming growthfactor-^ I, TGF-^ I)诱导上调,参与上皮细胞形态重塑及分化。最新研究发现FoxQl在肠癌组织中表达显著增高，Kaneda等研究表明FoxQl调控抑癌基因p21的表达，在肠癌发生、发展中起重要作用。Zhang等报道大多乳腺癌组织高表达FoxQl，在体外乳腺癌细胞中过表达FoxQl，可促进细胞增殖和克隆形成，增强癌细胞侵袭力，在体内过表达FoxQl能促进乳癌细胞肺转移。在肺癌的研究中，课题组已在前期实验中证实并于PLOS ONE杂志报道(P MID:22761930 ；do1:10.1371)，FoxQl在大多数非小细胞肺癌(NSCLC)组织中呈高表达，并且与肿瘤恶性程度和患者预后密切相关，FoxQl高表达的患者五年生存率明显低于低表达该基因的患者。因此，运用RNA干扰对NSCLC中Fo xQl进行抑制，会抑制NSCLC的生长，对NSCLC的生物学特性产生影响。
技术实现思路
专利技术目的:针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种靶向Fox Ql基因干扰小分子siRNA，使其能够特异性地沉默FoxQl基因。本专利技术目的另一目的是提供含有该干扰小分子siRNA的载体。本专利技术还有一目的是提供该干扰小分子siRNA的应用。本专利技术针对FoxQl的siRNA序列，可以是化学合成的也可以是通过表达载体稳定表达。针对FoxQl的siRNA序列，用脂质体、生物材料载体、病毒载体等形式来输送siRNA序列。本专利技术针对FoxQl基因的编码区序列，根据相对应的siRNA设计原则设计一对siRNA序列，并且通过转染人肺腺癌细胞，检测了对FoxQl基因的沉默效率，证实其有效性和特异性。然后将有效的siRNA片段设计成插入pGPU6/GFP/Neo载体的发夹siRNA插入片段，构建能够稳定表达shRNA的表达载体。技术方案:为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下:一种靶向FoxQl基因干扰siRNA，所述siRNA的序列如下:正义链:5'-GCCAAGCAAUUUCUUUAAATT-3'，反义链:5'-UUUAAAGAAAUUGCUUGGCTT-3'。一种克隆有所述的靶向FoxQl基因干扰siRNA的载体。所述的载体的构建方法:将特异性地沉默FoxQl基因的siRNA序列设计成能够插入载体中的发夹siRNA插入片段，然后与pGPU6/GFP/Neo载体进行连接，得到用于抗非小细胞肺癌生物学行为的干扰小分子RNA。所述的靶向FoxQl基因干扰siRNA在特异性地沉默FoxQl基因中的应用。有益效果:与现有技术相比，本专利技术运用荧光定量RT-PCR、Western Blot、CCK8法、Transwell小室模型、流式细胞术等现代分子生物学技术,成功构建出祀向FoxQl基因干扰siRNA，通过在细胞水平和动物水平研究干扰FoxQl基因后对肺癌细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡及化疗敏感性的影响，及对裸鼠成瘤能力的抑制作用，确定以FoxQl作为靶点治疗肺癌的可能性和协助化疗治疗肿瘤的作用，该siRNA在特异性地沉默FoxQl基因中的具有广泛的应用前景。【附图说明】图1是四株肺腺癌细胞中FoxQl基因mRNA和蛋白的表达水平的FoxQl基因表达结果图；图2是四株肺腺癌细胞中FoxQl基因mRNA和蛋白的表达水平的溶解曲线图；图3是四株肺腺癌细胞中FoxQl基因mRNA和蛋白的表达水平的扩增曲线图；图4是四株肺腺癌细胞中FoxQl基因mRNA和蛋白的表达水平的FoxQl蛋白表达图；图5是四株肺腺癌细胞中FoxQl基因mRNA和蛋白的表达水平的灰度值扫描图；图6是FoxQl基因干扰后对肺腺癌细胞增殖能力的影响结果图；图7是FoxQl基因干扰后对肺腺癌细胞侵袭迁移能力的侵袭能力的变化结果图；图8是FoxQl基因干扰后对肺腺癌细胞侵袭迁移能力的迁移能力变化的变化结果图；图9是FoxQl基因干扰后对肺腺癌细胞侵袭迁移能力的细胞统计图；图10是FoxQl基因干扰后对肺腺癌细胞凋亡能力的凋亡相关指标的变化结果图；图11是FoxQl基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种靶向FoxQ1基因干扰siRNA，其特征在于：所述siRNA的序列如下：正义链：5′?GCCAAGCAAUUUCUUUAAATT?3′，反义链：5′?UUUAAAGAAAUUGCUUGGCTT?3′。

【技术特征摘要】
1.一种靶向FoxQl基因干扰siRNA，其特征在于:所述siRNA的序列如下: 正义链:5' -GCCAAGCAAUUUCUUUAAATT-3'，反义链:5, -UUUAAAGAAAUUGCUUGGCTT-3'。2.一种克隆有权利要求1所述的靶向FoxQl基因干扰siRNA的载体。3.权利要求2所述的载...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯健，倪松石，许立芹，朱惠君，咸华，黄剑飞，
申请(专利权)人：南通大学附属医院，
类型：发明
国别省市：