本发明专利技术涉及一种发酵产耐高温β-半乳糖苷酶的菌株及其筛选方法，本发明专利技术所述菌株F69的分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2012年1月9日，保藏编号为：CGMCC?No.5699。本发明专利技术所述筛选方法的具体步骤依次包括：富集培养、初筛、菌株纯化、复筛、菌种保藏和β-半乳糖苷酶酶活性测定。该菌株产β-半乳糖苷酶发酵周期短、产β-半乳糖苷酶速度快、遗传稳定性好、pH稳定性好和催化活力强，且培养条件简便和生产安全性高，在食品和饲料等工业领域具有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一种发酵产耐高温P-半乳糖苷酶的菌株及其筛选方法
本专利技术属于生物工程
，特别是涉及一种产耐高温P -半乳糖苷酶的菌株及其筛选方法。
技术介绍
-半乳糖苷酶(P -galactosidase, EC3.2.1.23),学名为P -D-半乳糖苷半乳糖水解酶，商品名为乳糖酶，能够催化半乳吡喃糖苷水解或者转糖基化，常用于水解牛乳和其它乳制品中的乳糖，也可用来生成低聚半乳糖，广泛适用于低乳糖牛奶和非结晶型浓缩牛奶的生产，解决世界一半以上人口存在的乳糖不耐症问题，3 -半乳糖苷酶还具有半乳糖苷转移作用，用于生产双歧因子-低聚半乳糖，从而在益生菌食品生产中广泛应用。^-半乳糖苷酶在食品中的重要应用价值引起人们对它的广泛关注。P-半乳糖苷酶主要来源于动物、植物、细菌、酵母、真菌或霉菌。由于微生物的快速生长、高效代谢以及分离纯化相对简单等优势，使微生物(6-半乳糖苷酶成为工业化酶制剂的主要来湿。目前乳品工业用于分解乳糖的3 -半乳糖苷酶多从酵母、曲霉菌或乳酸菌中经诱导产酶后提取获得，但是均存在热稳定性差的缺点，严重限制了它在乳制品中的应用。如果采用耐高温P -半乳糖苷酶将可克服热稳定性差的缺陷，酶在60°C以上温度水解乳糖，可以有助于抑制杂菌微生物的生长。而且酶反应速度快，酶用量低，反应时间短，生产中可与巴氏杀菌同时进行或冷却阶段保温水解，即在巴斯德消毒过程中同时进行乳糖水解，省时、省工且能防止杂菌污染。尽管目前诸多文献报道了筛选分离多种(6-半乳糖苷酶菌株，如酵母菌、乳酸菌属、芽孢杆菌属、曲霉菌属等系列菌株的方案，但目前生产所用的 半乳糖苷酶大多最适作用温度在30°C左右，在高温下的酶活力都很低，且成本高，难以满足市场及生产所需。如何克服现有技术的不足，加快研发耐高温的(6-半乳糖苷酶产品已成为当今生物工程
中亟待解决的重点难题之一。
技术实现思路
本专利技术的目的是为克服现有技术的不足而提供一种发酵产耐高温P -半乳糖苷酶的菌株及其筛选方法，该菌株产3 -半乳糖苷酶发酵周期短、产3 -半乳糖苷酶速度快、遗传稳定性好、PH稳定性好和催化活力强，且培养条件简便和生产安全性高。根据本专利技术提出的一种发酵产耐高温P -半乳糖苷酶的菌株，其特征在于所述的菌株F69的分类命名为枯草芽孢杆菌{Bacillus Jis),保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期:2012年I月9日，保藏编号为=CGMCC N0.5699，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号。本专利技术所述的菌株F69 (CGMCC N0.5699)具有以下特性: (1)生长条件:枯草芽孢杆菌sy况27i50F69所产P-半乳糖苷酶的生长温度55~75°C，最适生长温度65°C ;所测P -半乳糖苷酶活力都在90%以上，表明该酶在较高的温度范围内催化活性很高，温度适应性强； (2)酶活性:在50°C~80°C下保温90min，残余酶活在80%以上，在80°C和90°C下保温60min，残余酶活分别为85%和65% ;表明枯草芽孢杆菌F69所产P -半乳糖苷酶具有很强的热稳定性； (3)弱酸性:在pH5.5~7.5之间酶活性在80%以上；在pH 4.5~7.5之间保持81%以上的酶活性，最适作用PH为6.5 ;表明(6-半乳糖苷酶在弱酸性及中性环境下非常稳定。根据本专利技术提出的一种发酵产耐高温(6-半乳糖苷酶的菌株的筛选方法，其特征在于依次包括如下具体步骤: 步骤一，富集培养:取土样Ig研细，加入装有80ml无菌水的250ml三角瓶中，加入无菌玻璃珠，在150r/min摇床中振荡20min，然后在80°C震荡水浴摇床中震荡30 min，取1-2ml于50 mL富集培养基中，40°C恒温水浴振荡培养36h_48h，震荡频率为150_180r/min ； 步骤二，初筛:将富集后的培养液进行10倍梯度稀释至稀释倍数为10_8，分别取10_6、10_7、10_8三个梯度的稀释液0.2ml涂布在初筛分离培养基平板上，平板晾至表面没有流动液体时，在40-42°C恒温培养箱中倒置培养24-36h，然后将培养温度降到32~35°C，继续培养24~72h ;挑取蓝色菌落 至另一个初筛分离培养基上，培养条件为:温度40-42°C、培养时间30-36h ;经培养后菌落呈现深浅不一的蓝色，进一步选取蓝色较深的菌株划线纯化； 步骤三，菌株纯化:将初筛出来的菌株，于牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线，置于40-42°C恒温培养箱中培养48h，重复划线培养三次以上，如连续多次在显微镜下观察到形态单一的菌体则认为菌株已纯化； 步骤四，复筛:初筛后将经过纯化的菌株接种到种子培养基中，容量为250ml的三角瓶装液量为30ml，在温度为40-45°C，震荡频率为160_180r/min下，恒温震荡摇床培养18-22h，然后按照4-6%的接种量接种到复筛发酵培养基中，摇床震荡发酵培养；发酵条件为:在250ml三角瓶中装培养基30-50ml，摇床震荡频率为160_200r/min、发酵温度40-45°C、发酵时间为36-48h ;发酵结束后，发酵液8000r/min离心lOmin，上清液为粗酶液，测定各粗酶液的3 -半乳糖苷酶酶活性；其中，菌株F69产3 -半乳糖苷酶活性最强，活力闻达 182U/ml ； 步骤五，菌种保藏:将复筛得到的菌种在斜面培养基上划线，40-45°C培养3天，然后置于4°C冰箱保存； 步骤六，(6-半乳糖苷酶酶活性测定:取500 UL待测酶液加入到已经预热到65°C的1.5 mL 含有 2 mmol/L ONPG 的 0.1 mol/L 磷酸缓冲液(pH 6.5)中，65°C水浴保温 10 min后，加入ImL lmol/L的碳酸钠溶液终止反应，J4tl5测定光吸收值，计算水解产物邻硝基酚的含量和酶的活性，同时以0.1 mol/L pH 6.5磷酸酸缓冲液代替酶液作为对照；乳糖酶活性的定义:1个单位的乳糖酶的活性为在pH 6.5、65°C下每分钟分解ONPG生成I y mo I邻硝基酚(ONP)所需的酶量。本专利技术与现有技术相比其显著优点在于:一是本专利技术所产(6-半乳糖苷酶的生长温度为55~75°C，最适反应温度为65°C，所测酶活力都在最高酶活的90%左右；酶在50°C~80°C下保温90min，残余酶活在80 %以上，具有优良的热稳定性；二是酶在pH4.5~7.5之间，酶活稳定，鉴于大多数乳制品及饮料的pH值也在这一范围内，故该酶的生化特性赋予了枯草芽孢杆菌F69菌株所产3 -半乳糖苷酶在乳制品加工中将有较强的应用优势；三是本专利技术筛选到的菌株遗传稳定性好，可连续传代10代以上，3 -半乳糖苷酶的合成能力不变；四是本专利技术的(6-半乳糖苷酶在高温下有良好的稳定性，在食品和饲料等工业领域具有广阔的应用前景。【附图说明】图1为产P -半乳糖苷酶菌株初筛平板示意图。图2以16S rDNA序列为基础的F69菌系统发育树示意图。图3本专利技术的耐高温(6-半乳糖苷酶最适作用温度示意图。图4本专利技术的耐高温P -半乳糖苷酶的热稳定性示意图。图5本专利技术的耐高温P -半乳糖苷酶最适作用pH示意图。图6本专利技术的耐高温P -半乳糖苷酶pH稳定性本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种发酵产耐高温β?半乳糖苷酶的菌株，其特征在于所述的菌株F69的分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus?subtilis)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2012年1月9日，保藏编号为：CGMCC?No.5699。
【技术特征摘要】
1.一种发酵产耐高温(6-半乳糖苷酶的菌株，其特征在于所述的菌株F69的分类命名为枯草芽孢杆菌{Bacillus,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期:2012年I月9日，保藏编号为=CGMCC N0.5699。2.根据权利要求1所述的一种发酵产耐高温(6-半乳糖苷酶的菌株，其特征在于所述的菌株F69 (CGMCC N0.5699)具有以下特性: (1)生长条件:枯草芽孢杆菌sy况27i50F69所产P-半乳糖苷酶的生长温度55~75°C，最适生长温度65°C ； (2)酶活性:在50°C~80°C下保温90min，残余酶活在80%以上，在80°C和90°C下保温60min，残余酶活分别为85%和65% ; (3)弱酸性:在pH5.5~7.5之间酶活性在80%以上，在pH 4.5~7.5之间保持81%以上的酶活性，最适作用pH为6.5。3.基于权利要求1所述的一种发酵产耐高温(6-半乳糖苷酶的菌株的筛选方法，其特征在于依次包括如下具体步骤: 步骤一，富集培养:取土样Ig研细，加入装有80ml无菌水的250ml三角瓶中，加入无菌玻璃珠，在150r/min摇床中振荡20min，然后在80°C震荡水浴摇床中震荡30 min，取1-2ml于50 mL富集培养基中，40°C恒温水浴振荡培养36h_48h，震荡频率为150_180r/min ； 步骤二，初筛:将富集后的培养液进行10倍梯度稀释至稀释倍数为10_8，分别取10_6、.10_7、10_8三个梯度的稀释液0.2ml涂布在初筛分离培养基平板上，平板晾至表面没有流动液体时，在40~42°C恒温培养箱中倒置培养24~36h，然后将培养温度降到32~35°C，继续培养24~72h ;挑取蓝色菌落至另一个初筛分离培养基上，培养条件为:温度40~42°C，培养时间30~36h ;经培养后菌落呈现深浅不一的蓝色，进一步选取蓝色较深的菌株划线纯化； 步骤三，菌株纯化:将初筛出来的菌株，于牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线，置于40~.42°C恒温培养箱中培养48h，重复划线培养三次以上，如连续多次在显微镜下观察到形态单一的菌体则认为菌株已纯化； 步骤四，复筛:初筛后将经过纯化的菌株接种到种子培养基中，容量为250ml的三角瓶装液量为30ml，在温度为40~45°C，震荡频率为160~180r/min下，恒温震荡摇床培养.18-22h，然后按照4~6%的接种量接种到复筛发酵培养基中，摇床震荡发酵培养，发酵条件为:在250ml三角瓶中装培养基30~50ml，摇床震荡频率为160_200r/mi...
【专利技术属性】
技术研发人员：高兆建，李勇，张桂英，张建萍，张家路，司瑞寒，田圣英，
申请(专利权)人：徐州工程学院，
类型：发明
国别省市：
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