生物样品中的核酸分子的检测方法技术

本核酸分子的检测方法具有如下工序：制备包含核酸探针和生物样品的样品溶液的工序，所述核酸探针与分析对象的核酸分子特异地杂交；使前述制备工序中制备的样品溶液中的核酸分子与前述核酸探针缔合的工序；和在前述缔合工序后，通过扫描分子计数法计算前述制备工序中制备的样品溶液中的、包含前述核酸探针的缔合体的分子数的工序；该方法具有：在前述计算工序之前从前述样品溶液中去除蛋白质的工序、或者在前述制备工序之前从前述生物样品中去除蛋白质的工序。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及使用共聚焦显微镜、多光子显微镜的光线系统等能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学体统从而检测生物样品中的核酸分子的方法。本申请基于2011年4月20日在日本提交的特愿2011-094293号要求优先权，本文援引其内容。
技术介绍
随着近年来光学测量技术的发展，使用共聚焦显微镜的光学系统和也能够光子计数(单光子检测)的超高灵敏度的光检测技术，能够检测/测定单光子或单分子荧光水平的微弱光。因此，提出了使用前述的这类微弱光的检测技术检测生物分子等分子间相互作用或结合/解离反应的各种装置或方法。例如，对于突光相关光谱分析(FluorescenceCorrelation Spectroscopy:FCS。例如,参见专利文献1、2、非专利文献I?3)中，使用激光共聚焦显微镜的光学系统和光子计数技术，测定来自在样品溶液中的微小区域(显微镜的激光聚光而成的焦点区域，被称为共焦体积(confocal volume)。)内出入的荧光分子或进行了突光标记的分子(突光分子等)的突光强度。突光相关光谱分析基于由测定的突光强度的自相关函数的值所决定的微小区域内部的荧光分子等的平均滞留时间(平移扩散时间)以及滞留的分子数的平均值，取得荧光分子等的运动速度或大小、浓度的信息。或者，荧光相关光谱分析基于前述的荧光分子等的平均滞留时间以及滞留的分子数的平均值，检测分子的结构或大小的变化、分子的结合/解离反应或者分散/聚集等各种现象。此外，利用突光强度分布分析(Fluorescence-1ntensity Distribution Analysis:FIDA。例如，专利文献3)或光子计数直方图(Photon Counting Histogram:PCH。例如，专利文献4)中，生成与FCS同样计算的在共焦体积内出入的荧光分子等的荧光强度的直方图。荧光强度分布分析中，对于生成的直方图的分布通过统计学模型式进行拟合，计算荧光分子等的固有亮度的平均值和滞留在共焦体积内的分子数的平均值。荧光强度分布分析根据上述信息，推测分子结构或大小的变化、结合/解离状态、分散/聚集状态等。此外，专利文献5、6中公开了:基于使用共聚焦显微镜的光学系统测定出的样品溶液的荧光信号的时程，检测荧光性物质的方法。专利文献7公开了一种信号运算处理技术，其用于:使用光子计数技术，测量在流式细胞仪内流过的荧光微粒或固定在基板上的荧光微粒所发出的微弱光，检测液流中或基板上存在的荧光微粒。特别的是，通过应用FCS、FIDA等、使用了共聚焦显微镜的光学系统和光子计数技术的微小区域的荧光测量技术的方法，测定所必需的样品浓度比以前低得多且可以是微量(每次测定中可重复进行数次的秒数量级时间的测定。)。另外，通过上述的方法，测定时间大幅地缩短(每次测定中秒数量级的时间的测量可重复数次)。因此，这些技术特别是例如在以下的情况下，与现有的生物化学的方法相比较，能够低廉地或者迅速地进行实验或检测，可以期待成为强效的工具:.在医学/生物学的研究开发领域中，针对经常使用的稀少或者高价的样品进行分析的情况。.用于疾病的临床诊断或筛选生理活性物质等被检体数量多的情况下。另一方面，对于检测具有特定碱基序列的核酸的方法，已大量报道了使用探针或引物等人工合成的短链寡核苷酸研究核酸的碱基序列的方法。特别是，生物样品通常如临床检查中的被检体等是微量的情况多。因此，分析生物样品中的核酸时，将该生物样品中所含的核酸使用PCR等通常的分子生物学的手法扩增后或者与扩增同时地检测靶核酸的方法是通用的。另外，生物样品中通常除了核酸以外还含有多种多样的物质，有时还包含核酸扩增反应的抑制物质。因此，利用核酸扩增反应精度良好地检测核酸的情况下，为了降低以核酸扩增反应的抑制物质为代表的杂质的影响，预先从生物样品中选择性提取核酸并回收是必要的。例如，专利文献8中公开有，通过使用了磁性粒子的核酸回收方法从生物样品中提取核酸，接着使用核酸扩增法这样的通常的分子生物学的手法从提取的核酸中检测靶核酸的方法。另外，专利文献9公开有使血液凝固之后，对于得到的血清进行核酸扩增处理，由此将血液中所含的核酸扩增反应的抑制物质去除，扩增靶核酸而进行检测的方法。其他的，专利文献10中公开有对于将血液稀释、加热后的样品进行核酸扩增处理而检测靶核酸的方法。现有技术文献专利文献专利文献1:日本特开2005-098876号公报专利文献2:日本特开2008-292371号公报专利文献3:日本专利第4023523号公报专利文献4:国际公开第2008-080417号公报专利文献5:日本特开2007-20565号公报专利文献6:日本特开2008-116440号公报专利文献7:日本特开平4-337446号公报专利文献8:日本专利第2965131号公报专利文献9:日本专利第3575633号公报专利文献10:日本特开2006-187221号公报非专利文献非专利文献1:金城政孝、蛋白質核酸酵素、1999年、第44卷、第9号、第1431?1438 页。非专利文献2:Meyer-Alms、Fluorescence Correlation Spectroscopy>R.Rigler著、Springer、柏林、2000 年、第 204 ?224 页。非专利文献3:加藤则子等4名、遺伝子医学、2002年、第6卷、第2号、第271?277 页。
技术实现思路
专利技术要解决的问题上述FCS、FIDA、PCH等光分析技术简而言之是通过统计学处理计算所测量的荧光强度随时间波动的大小，根据该波动的大小确定在样品溶液中的微小区域内部出入的荧光分子等的各种特性。因此，为了在上述光分析技术中获得有意义的结果，就样品溶液中作为观察对象的荧光分子等的浓度或数密度而言，优选制备成使平衡状态下出入于微小区域内部的荧光分子等的数量为能够在每次长度为秒数量级的测量时间内进行统计学处理的数量。优选适宜制备成为在微小区域内经常地存在有一个左右的荧光分子等。典型地，共焦体积成为IfL程度，所以荧光分子等的浓度优选为InM程度或者以上。换言之，当样品溶液中的观测对象粒子的浓度或数密度与能够统计学处理的程度相比大幅下降时(例如，大幅低于InM时)，出现了观测对象物在测量时间内很少进入微小区域内的状态，在荧光强度的测量结果中，长时间地包含观测对象物在微小区域内完全不存在的状态，并且显著的荧光强度的观测量减少。结果，如上所述的基于荧光强度的统计学波动的光分析技术，无法获得有意义的或精度良好的分析结果。在专利文献5、6中记载的使用共聚焦显微镜的光学系统检测荧光物质的方法中，公开了:不进行如上所述的关于荧光强度波动的统计学处理，而可以获得显著强度的荧光信号的频率与样品中的荧光分子等的粒子数的相关性。这是因为，通过持续数秒的测量时间中有无产生显著强度的荧光信号，可以查清样品中有无作为观察对象的荧光分子等。特别是在专利文献6中，提出了产生搅拌样品溶液的随机流动时，检测灵敏度提高。然而，这些方法只能检测由于扩散或随机流动而存在的概率性进入微小区域内部的荧光分子等的存在，而不能掌握荧光分子等粒子在微小区域内部的行为。例如不能实现粒子的计数、定量计算粒子的浓度或数密度。此外，专利文献7中记载的技术是逐个检测流本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸分子的检测方法，具有以下工序：制备包含核酸探针和生物样品的样品溶液的工序，所述核酸探针与分析对象的核酸分子特异地杂交；使所述制备工序中制备的样品溶液中的核酸分子与所述核酸探针缔合的工序；和在所述缔合工序后，计算所述制备工序中制备的样品溶液中的、包含所述核酸探针的缔合体的分子数的工序；所述方法通过如下的工序而进行：移动所述计算工序中的所述样品溶液内的共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的光检测区域的位置的工序；一边在所述样品溶液内部移动所述光学系统的光检测区域的位置，一边检测所述光检测区域中的由所述缔合体发出的荧光的工序；由所述检测到的光逐个检测来自每个缔合体的光信号而逐个检测缔合体的工序；和将所述逐个检测到的缔合体的个数进行计数而计数所述光检测区域的位置的移动中所检测到的所述粒子的个数的工序；所述方法具有：在所述计算工序之前从所述样品溶液中去除蛋白质的工序、或者在所述制备工序之前从所述生物样品中去除蛋白质的工序。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.04.20 JP 2011-0942931.一种核酸分子的检测方法，具有以下工序: 制备包含核酸探针和生物样品的样品溶液的工序，所述核酸探针与分析对象的核酸分子特异地杂交； 使所述制备工序中制备的样品溶液中的核酸分子与所述核酸探针缔合的工序；和在所述缔合工序后，计算所述制备工序中制备的样品溶液中的、包含所述核酸探针的缔合体的分子数的工序； 所述方法通过如下的工序而进行: 移动所述计算工序中的所述样品溶液内的共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的光检测区域的位置的工序； 一边在所述样品溶液内部移动所述光学系统的光检测区域的位置，一边检测所述光检测区域中的由所述缔合体发出的荧光的工序； 由所述检测到的光逐个检测来自每个缔合体的光信号而逐个检测缔合体的工序；和将所述逐个检测到的缔合体的个数进行计数而计数所述光检测区域的位置的移动中所检测到的所述粒子的个数的工序； 所述方法具有:在所述计算工序之前从所述样品溶液中去除蛋白质的工序、或者在所述制备工序之如从所述生物样品中去除蛋白质的工序。2.根据权利要求1所述的核酸分子的检测方法，其具有:在所述缔合工序之后、所述计算工序之前，从所述样品溶液中去除蛋白质的工序。3.根据权利要求1或2所述的核酸分子的检测方法，其中，如下进行由所述样品溶液或所述生物样品的蛋白质的去除:使 所述样品溶液或所述生物样品中的核酸分子吸附于无机支撑体之后，使吸附的核酸由无机支撑体脱附。4.根据权利要求1~3的任一项所述的核酸分子的检测方法，其中，所述生物样品在由生物采集之后进行了蛋白水解酶处理。5.根据权利要求1~4的任一项所述的核酸分子的检测方法，其中，所述核酸探针是被荧光物质标记的。6.根据权利要求1~4的任一项所述的核酸分子的检测方法，其中， 所述核酸探针被荧光物质标记， 在所述制备工序中，所述样品溶液中进一步包含灭光性双链核Ife结合物质； 标记了所述核酸探针的荧光物质和所述荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：西川和孝，
申请(专利权)人：奥林巴斯株式会社，
类型：
国别省市：