表达方法技术

本发明专利技术的目的是提高微生物发酵中的蛋白质产率。这通过下述方法来实现，所述方法中不仅将编码所述蛋白质的第一表达构建体引入到所述微生物中，还将第二表达构建体引入到所述微生物中，所述第二表达构建体编码不同于所述蛋白质的辅助蛋白酶，所述辅助蛋白酶具有蛋白水解活性且包含与SEQ?ID?NO.1中所示的氨基酸序列具有至少50%同一性的氨基酸序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术属于生物技术，更具体而言，微生物蛋白质合成领域。本专利技术尤其涉及利用遗传修饰的微生物制备蛋白质的方法，此外，提出用于这类方法的微生物。本专利技术还涉及这类微生物在蛋白质制备中的用途。微生物可以用来制备有价值的物质。有价值的物质是例如低分子量化合物(例如食品添加剂或药物活性化合物)或蛋白质，对于蛋白质，由于蛋白质的多样性，又存在巨大的工业应用领域。首先，为了制备有价值的物质而开发和/或修饰所讨论的微生物的代谢性质；其次，优选使用表达目的蛋白质的基因的微生物。对于工业规模的生物技术生产，将所讨论的微生物培养在相应地适应于所述微生物的代谢性质的发酵罐中。培养过程中，微生物代谢所提供的底物，并形成希望的产物，通常在发酵结束后将该产物与生产微生物分离，并从发酵浆液和/或发酵培养基纯化和/或浓缩所述产物。在蛋白质的发酵生产中，除碳源(通常为葡萄糖)外，通常将富含复合蛋白的原料用作底物。因此，蛋白质生产对应于底物蛋白至靶蛋白的生物转化。这需要将底物蛋白完全水解为单个氨基酸，然后该氨基酸可用于靶蛋白的生物合成。因此，对于微生物的发酵，存在综合的现有技术，其从所讨论的菌株的优化(例如关于形成的速率和营养物利用)延伸至发酵罐的技术设计，以从所讨论的微生物和/或发酵培养基获得有价值的物质。通常,微生物发酵中希望得到非常高的产品产率(product yield)。例如，国际专利申请W091/02792公开了来自迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)的碱性蛋白酶在来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的基因调节序列(更具体而言,地衣芽孢杆菌启动子)的控制下在优化的地衣芽孢杆菌菌株中的改善的发酵生产。来自 Wu 等的出版物(J.Bacteriol.173 (16)，4952 - 8 (1991) ; Appl.Environ.Microbiol.68(7)，3261 - 9(2002))提出关闭微生物内源表达的蛋白酶，以提高靶蛋白的产率。这旨在防止靶蛋白的蛋白水解降解，将微生物的合成能力集中在希望的产物上。仍然存在对允许高产品产率的微生物发酵方法的巨大需求。现已发现，令人惊奇地，与前述出版物相反，特别地，额外表达特定的辅助蛋白酶对产品产率有利。本专利技术的目的是提高微生物发酵中的产率，尤其是蛋白质的产率。本专利技术提供利用微生物制备蛋白质的方法，其包括方法步骤:(a)将编码所述蛋白质的第一表达构建体引入到所述微生物中；(b)将编码辅助蛋白酶的第二表达构建体引入到所述微生物中，所述辅助蛋白酶不同于所述蛋白质，且包含与SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列具有至少50%的同一的氨基酸序列，其中所述辅助蛋白酶具有蛋白水解活性；(c)在所述微生物中表达所述蛋白质和辅助蛋白酶。根据本专利技术的方法任选地进一步包括其他方法步骤:(d)培养所述微生物。因此，在根据本专利技术的优选实施方案中，根据本专利技术的方法是发酵方法。意外地,在微生物中引入和表达辅助蛋白酶未例如由于所表达的辅助蛋白酶的蛋白水解活性(其可以降解所合成的靶蛋白)而导致蛋白质产率(靶蛋白)降低。相反，辅助蛋白酶的表达导致蛋白质产率提高。在本专利技术的优选实施方案中，辅助蛋白酶涉及底物蛋白的水解，并优选与微生物的其他染色体编码的蛋白酶(=背景蛋白酶)一起导致底物蛋白的消化的改善，使得生产过程中每单位时间有更多的所需前体分子(尤其是氨基酸)可用于靶蛋白的合成。因此，在根据本专利技术的这类实施方案中，就微生物的底物消化而言，背景蛋白酶的底物特异性和辅助蛋白酶的底物特异性有利地彼此互补。在这方面，在本专利技术的其他优选实施方案中，辅助蛋白酶不需要占发酵产物的显著比例。在这方面，辅助蛋白酶对蛋白质的表达，由此对蛋白质产率具有有益作用，但其在发酵产物中的比例优选很小或甚至不可确定。优选地，辅助蛋白酶在发酵产物中的比例以重量计小于 25%，且优选小于 20%、15%、10%、8%、7%、6%、5%、2.5%、2%、1.5%、1%、0.5%、0.1% 和0.05%。在这方面，发酵产物是这样的组合物，其中在已进行根据本专利技术的方法、已在培养基中培养微生物和任选地为了从微生物释放蛋白质已破裂微生物(如果所述微生物不分泌蛋白质)后存在该蛋白质。优选地，已将微生物或其片段与发酵产物分离。在优选实施方案中，根据本专利技术的方法是用于提高蛋白质在微生物中的表达的方法。与相似的方法相比，根据本专利技术的方法产生更大量的蛋白质，提高了蛋白质表达，所述相似的方法与根据本专利技术的方法的不同仅在于省去了所述方法的方法步骤b)，结果导致方法步骤c)中无辅助蛋白酶表达。在这方面，用于比较的两种方法在相同的条件、相同的持续时间，使用仅因辅助蛋白酶的存在或缺乏而不同的微生物进行。表达构建体是使得蛋白质或辅助蛋白酶能够在微生物中表达的核酸序列。它包含遗传信息，即编码该蛋白质或该辅助蛋白酶的核酸序列(基因)。核酸序列的表达是所述序列翻译为它所编码的基因产物，即翻译为多肽(蛋白质)或翻译为多种多肽(蛋白质)。术语多肽和蛋白质在本申请中作为同义词使用。对于本专利技术的目的，表达意指从遗传信息生物合成核糖核酸(RNA)和蛋白质。通常，表达包括转录，即根据基因的DNA (脱氧核糖核酸)序列合成信使核糖核酸(mRNA)，以 及mRNA翻译为对应的多肽链，该多肽链可以额外地进行翻译后修饰。因此，蛋白质的表达描述了从存在于根据本专利技术的微生物中的遗传信息生物合成所述蛋白质。表达构建体进一步包含对编码所述蛋白质或辅助蛋白酶的核酸序列的表达具有调控功能的至少一种核酸序列，优选DNA (称为基因调节序列)。在这种情况下，基因调节序列是通过其在特定微生物中的存在来影响(优选提高)编码蛋白质或辅助蛋白酶的核酸序列的转录速率的任意核酸序列。优选地，它是启动子序列，因为这种序列为核酸序列的表达所必需。然而，根据本专利技术的表达构建体还可以包含其他基因调节序列，例如一个或多个增强子序列。因此，用于本专利技术的目的的表达构建体包含由基因和启动子组成的至少一个功能单位。它可以但并非必须以物理实体存在。至少一个启动子的存在为根据本专利技术的表达构建体所必需。因此，启动子理解为意指允许调苄基因表达的DNA序列。启动子序列是基因的天然组分，且通常定位在5’端，因此在RNA编码区之前。优选地，根据本专利技术的表达构建体中的启动子序列定位在编码蛋白质或辅助蛋白酶的核酸序列的5’上游。启动子最重要的性质是与至少一种DNA结合蛋白或多肽特异地相互作用，所述DNA结合蛋白或多肽介导通过RNA聚合酶进行的基因转录的起始，称为转录因子。通过RNA聚合酶进行的转录起始常涉及多种转录因子和/或其他蛋白质。因此，启动子优选是具有启动子活性的DNA序列，即至少瞬时结合至少一种转录因子以起始基因转录的DNA序列。启动子的强度可通过所表达的基因的转录速率来测量，即通过每单位时间产生的RNA分子，具体而言，mRNA分子的数目来测量。根据本专利技术的表达构建体的启动子可以是微生物的内源启动子。因此，这种启动子序列天然存在于微生物中。备选地，还可以以重组方式将根据本专利技术的表达构建体的启动子引入微生物中。相同的情况还适用于根据本专利技术的表达构建体可以具有的所有其他基因调节序列。第一表达构建体编码蛋白质。因此，它包含编码所本文档来自技高网...

【技术保护点】
利用微生物制备蛋白质的方法，其包括方法步骤：（a）将编码所述蛋白质的第一表达构建体引入到所述微生物中；（b）将编码辅助蛋白酶的第二表达构建体引入到所述微生物中，所述辅助蛋白酶不同于所述蛋白质，且包含与SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列具有至少50%的同一性的氨基酸序列，其中所述辅助蛋白酶具有蛋白水解活性；（c）在所述微生物中表达所述蛋白质和辅助蛋白酶。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.04.13 DE 102011007313.21.利用微生物制备蛋白质的方法，其包括方法步骤: (a)将编码所述蛋白质的第一表达构建体引入到所述微生物中； (b)将编码辅助蛋白酶的第二表达构建体引入到所述微生物中，所述辅助蛋白酶不同于所述蛋白质，且包含与SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列具有至少50%的同一性的氨基酸序列，其中所述辅助蛋白酶具有蛋白水解活性； (c)在所述微生物中表达所述蛋白质和辅助蛋白酶。2.根据权利要求1的方法，其中所述蛋白质非天然地存在于所述微生物中和/或所述辅助蛋白酶非天然地存在于所述微生物中。3.根据权利要求1或2的方法，其中所述辅助蛋白酶替换所述微生物中至少一种染色体编码的蛋白酶，或其中除染色体编码的蛋白酶外，所述辅助蛋白酶在所述微生物中表达。4.根据权利要求3的方法，其中所述辅助蛋白酶替换所述微生物中的至少一种染色体编码的蛋白酶，所述染色体编码的蛋白酶包含与SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。5.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中所述辅助蛋白酶的表达使所述蛋白质的表达增加。6.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中所述蛋白质是酶，更特别地是蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、鞣酸酶、木聚糖酶、黄原胶酶、木葡聚糖酶、β -葡糖苷酶、果胶酶、卡拉胶酶、过氧化氢酶、氧化酶、氧化还原酶或脂肪酶。7.根据权利要求1至6中 任一项的方法，其中所述微生物是细菌，其优选地选自下述细菌之一:埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、芽抱杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、棒杆菌属(Corynebakterium)> 节杆菌属(Arthrobacter)、链霉菌属(Streptomyces)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)和弧菌属(Vibrio);更优选地，所述细菌选自下列细菌之一:大肠杆菌(Escherichia coli)、植生克雷伯氏菌(Klebsiellaplanticola)、荚壳伯克氏菌(Burkholderia glumae)、地衣芽抱杆菌(Bacilluslichenifo...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·马克西姆，R·克纳布，S·埃弗斯，KH·莫勒，J·邦加特斯，
申请(专利权)人：巴斯夫欧洲公司，
类型：
国别省市：