一种中华绒螯蟹小核糖核酸病毒的保存实验方法技术

本发明专利技术适用于兽医生物制品保存技术领域，提供了一种中华绒螯蟹小核糖核酸病毒的保存实验方法，所述方法包括下述步骤：对患中华绒螯蟹小核糖核酸病毒病的病蟹组织材料进行三种不同方法的保存，然后对保存预定时间后的病蟹组织材料进行过滤液的制备，采用注射病毒过滤液的人工感染健康蟹方式，通过蟹死亡率和平均死亡天数指标的统计分析来评价三种保存方法的保存效果，从而获取对中华绒螯蟹小核糖核酸病毒病的保存方式，为非发病季节对病毒材料进行保存提供了有力的支持。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于兽医生物制品保存
，尤其涉及。
技术介绍
中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)小核糖核酸病毒病也称为河蟹抖抖病、河蟹颤抖病以及河蟹环爪病，该病具有流行广、危害大的特点，是造成河蟹大批死亡的主要病害之一，其主要症状表现为在疾病的充分发展期蟹的步足出现严重抖动现象，临近死亡或刚死亡时步足向其腹部方向成环抱的僵直状态，该病的病因是由小核糖核酸病毒科病毒引起的。对病毒病以及病原的深入研究，必须具有具毒力的病毒材料，对中华绒螯蟹小核糖核酸病毒病的深入研究也是如此。在尚无建立对该病毒敏感细胞株的当今，获得具毒力的病毒材料只能从自然发病的病蟹中采集或通过人工感染的方式在发病蟹中收集。由于该病的自然发病具有季节性，因而在非发病季节病料的获得极为困难，人工感染获得病毒材料十分费时又费力，同时人工感染前需要有一定量的毒种。因此，在中华绒螯蟹的发病季节对病毒材料进行保存成为非发病季节对病毒的研究的重要环节之一。但是目前对病毒材料的保存没有一种统一的标准，各种保存方式都有，各有各的优点，不能提供一种操作简便、保存时间长、保存量大、对中华绒螯蟹小核糖核酸病毒进行有效保存的方法。
技术实现思路
本专利技术实施例的目的在于提供，旨在解决现有技术中目前对病毒材料的保存没有一种统一的标准，各种保存方式都有，各有各的优点，不能提供一种操作简便、保存时间长、保存量大、对中华绒螯蟹小核糖核酸病毒进行有效保存的方法的问题。本专利技术实施例是这样实现的，，所述保存实验方法包括下述步骤:(I)、对含有中华绒螯蟹小核糖核酸病毒的病蟹进行清洗消毒，然后对清洗消毒后的病蟹进行组织解剖，得到病蟹的病毒组织材料；(2)、取部分所述病蟹的病毒组织材料分别保存于三种不同的保存环境中，分别为:袋装密封于普通冰箱冷冻室、袋装密封于低温冰箱冷冻室和浸入50%甘油磷酸缓冲液中存放于普通冰箱冷藏室；(3)、根据预定的保存时间，分别取出保存在所述三种保存环境中的病蟹病毒组织材料，分别制备病蟹病毒过滤液，并将制备的病蟹病毒过滤液分别注射到对应的健康蟹上，形成实验组，同时，设置一对照组，对所述实验组和所述对照组分别进行对照观察；(4)、对健康蟹的死亡率和死亡天数通过标准差和F检验的方式进行评价，得到各种保存方式的差异性数据，确定不同保存方式的保存效果。作为一种改进，所述步骤(1)具体包括下述步骤:病蟹用清水洗刷干净后，分别用75%酒精棉球消毒蟹甲壳和步足的表面；无菌操作打开甲壳，用灭过菌的剪刀、镊子、解剖刀取出所有病蟹的肝胰腺、心脏、腹神经节；将病蟹上取出的组织混匀后，形成病蟹病毒组织材料。作为一种改进，所述步骤(3)具体包括下述步骤:保存于50%甘油磷酸缓冲液中的病毒组织材料取出后，用无菌生理盐水冲洗4~5次；普通冰箱和低温冰箱保存的病毒组织材料取出后在室温下融化；然后分别对上述三种实验病毒组织材料进行称重，并加入3倍于组织重量的无菌生理盐水 ；用灭菌的玻璃研磨管对病蟹组织进行研磨，组织细胞充分破碎后，每分钟2000转离心10分钟去除蟹油以及大的颗粒物质；去除蟹油以及大的颗粒物质后，进行每分钟7000转低温离心半小时；取离心后的清液，用0.22 μ m孔径大小的无菌微孔滤膜过滤；使用灭菌针筒吸取过滤液从健康蟹第三步足基部注射到蟹的腹腔内，每只健康蟹注射0.3ml ；实验期间每天定时计数蟹的死亡数。作为一种改进，所述普通冰箱冷冻室的温度为_16°C，所述低温冰箱冷冻室的温度为_74°C，所述普通冰箱冷藏室的温度为2°C。本专利技术实施例中，对患中华绒螯蟹小核糖核酸病毒病的病蟹组织材料进行三种不同方法的保存，然后对保存预定时间后的病蟹组织材料进行过滤液的制备，采用注射病毒过滤液的人工感染健康蟹方式，通过蟹死亡率和平均死亡天数指标的统计分析来评价三种保存方法的保存效果，从而获取对中华绒螯蟹小核糖核酸病毒病的保存方式，为非发病季节对病毒材料进行保存提供了有力的支持。【具体实施方式】为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术实施例在于提供一种操作简便、保存时间长、保存量大、对中华绒螯蟹小核糖核酸病毒进行有效保存，能满足该病在非发病季节进行科学研究的中华绒螯蟹小核糖核酸病毒保存技术。下述给出了中华绒螯蟹小核糖核酸病毒的保存实验方法，其具体包括下述步骤:(I)、对含有中华绒螯蟹小核糖核酸病毒的病蟹进行清洗消毒，然后对清洗消毒后的病蟹进行组织解剖，得到病蟹的病毒组织材料；(2)、取部分所述病蟹的病毒组织材料分别保存于三种不同的保存环境中，分别为:袋装密封于普通冰箱冷冻室、袋装密封于低温冰箱冷冻室和浸入50%甘油磷酸缓冲液中存放于普通冰箱冷藏室；(3)、根据预定的保存时间，分别取出保存在所述三种保存环境中的病蟹病毒组织材料，分别制备病蟹病毒过滤液，并将制备的病蟹病毒过滤液分别注射到对应的健康蟹上，形成实验组，同时，设置一对照组，对所述实验组和所述对照组分别进行对照观察；(4)、对健康蟹的死亡率和死亡天数通过标准差和F检验的方式进行评价，得到各种保存方式的差异性数据，确定不同保存方式的保存效果。其中，人工感染病毒后，用健康蟹的死亡率和平均死亡天数来评价病毒三种保存方法的保存效果。平均死亡天数、标准差和F检验等数据统计分析按照薛仲三的方法进行，F检验值反映每个实验组各个保存时间的病毒人工感染健康蟹后平均死亡天数之间的差异性，Q值反映每个实验组两个保存时间的病毒经人工感染健康蟹后平均死亡天数之间的差异性。 在该实施例中，步骤(1)具体包括下述步骤:病蟹用清水洗刷干净后，分别用75%酒精棉球消毒蟹甲壳和步足的表面；无菌操作打开甲壳，用灭过菌的剪刀、镊子、解剖刀取出所有病蟹的肝胰腺、心脏、腹神经节；将病蟹上取出的组织混匀后，形成病蟹病毒组织材料。在本实施例中，上述步骤(3)具体包括下述步骤:保存于50%甘油磷酸缓冲液中的病毒组织材料取出后，用无菌生理盐水冲洗4~5次；普通冰箱和低温冰箱保存的病毒组织材料取出后在室温下融化；然后，分别对上述三种实验病毒组织材料进行称重，并加入3倍于组织重量的无菌生理盐水；用灭菌的玻璃研磨管对病蟹组织进行研磨，组织细胞充分破碎后，每分钟2000转离心10分钟去除蟹油以及大的颗粒物质；去除蟹油以及大的颗粒物质后，进行每分钟7000转低温离心半小时；取离心后的清液，用0.22 μ m孔径大小的无菌微孔滤膜过滤；使用灭菌针筒吸取过滤液从健康蟹第三步足基部注射到蟹的腹腔内，每只健康蟹注射0.3ml ；实验期间每天定时计数蟹的死亡数。其中，每次实验都设对照组，对照组的健康蟹来源、大小、只数和室内养殖等条件完全和试验组一样，每只蟹注射0.3ml无菌生理盐水。共观察45天。对照组的蟹在45天试验期内均成活并无异常情况。当然，普通冰箱冷冻室的温度为-16°C，低温冰箱冷冻室的温度为-74V，普通冰箱冷藏室的温度为2°C。在本实施例中，三种保存方法中低温冰箱冷冻(_74°C )保存的保存效果最好，其次是50%甘油磷酸缓冲液中冷藏(2°C )保存的方法，而普通冰箱冷冻(_16°C )保存的保存效果最差，它们的保存时间分别本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种中华绒螯蟹小核糖核酸病毒的保存实验方法，其特征在于，所述保存实验方法包括下述步骤：(1)、对含有中华绒螯蟹小核糖核酸病毒的病蟹进行清洗消毒，然后对清洗消毒后的病蟹进行组织解剖，得到病蟹的病毒组织材料；(2)、取部分所述病蟹的病毒组织材料分别保存于三种不同的保存环境中，分别为：袋装密封于普通冰箱冷冻室、袋装密封于低温冰箱冷冻室和浸入50％甘油磷酸缓冲液中存放于普通冰箱冷藏室；(3)、根据预定的保存时间，分别取出保存在所述三种保存环境中的病蟹病毒组织材料，分别制备病蟹病毒过滤液，并将制备的病蟹病毒过滤液分别注射到对应的健康蟹上，形成实验组，同时，设置一对照组，对所述实验组和所述对照组分别进行对照观察；(4)、对健康蟹的死亡率和死亡天数通过标准差和F检验的方式进行评价，得到各种保存方式的差异性数据，确定不同保存方式的保存效果。

【技术特征摘要】
1.一种中华绒螯蟹小核糖核酸病毒的保存实验方法，其特征在于，所述保存实验方法包括下述步骤: (1)、对含有中华绒螯蟹小核糖核酸病毒的病蟹进行清洗消毒，然后对清洗消毒后的病蟹进行组织解剖，得到病蟹的病毒组织材料； (2)、取部分所述病蟹的病毒组织材料分别保存于三种不同的保存环境中，分别为:袋装密封于普通冰箱冷冻室、袋装密封于低温冰箱冷冻室和浸入50%甘油磷酸缓冲液中存放于普通冰箱冷藏室； (3)、根据预定的保存时间，分别取出保存在所述三种保存环境中的病蟹病毒组织材料，分别制备病蟹病毒过滤液，并将制备的病蟹病毒过滤液分别注射到对应的健康蟹上，形成实验组，同时，设置一对照组，对所述实验组和所述对照组分别进行对照观察； (4)、对健康蟹的死亡率和死亡天数通过标准差和F检验的方式进行评价，得到各种保存方式的差异性数据，确定不同保存方式的保存效果。2.根据权利要求1所述的中华绒螯蟹小核糖核酸病毒的保存实验方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括下述步骤: 病蟹用清水洗刷干净后，分别用75%酒精棉球消毒蟹甲壳和步足的表面； 无菌操作打开甲壳，用灭过菌的剪刀、镊子、解剖刀取出所有病蟹...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱光来，
申请(专利权)人：江苏畜牧兽医职业技术学院，
类型：发明
国别省市：