用于侦测一目标核苷酸序列中之一特定区域的一突变和/或多态性的试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种用于侦测一目标核苷酸序列中之一特定区域的一突变和/或多态性的试剂盒，包括：至少一第一引物，由一第一片段与一第二片段所组成，该第一片段为一第一序列之互补链而该第二片段为一第二序列，该第一片段之3’端连接该第二片段之5’端；一第二引物，该第二引物为一第三序列；至少一第三引物，由一第三片段与一第四片段所组成，该第三片段为一第四序列而该第四片段为一第五序列之互补链，该第三片段之3’端连接该第四片段之5’端；以及一第四引物，其中该第四引物为一第六序列之互补链，其中该特定区域包括rs1799853、rs1057910、rs2108622、rs9923231或rs9934438。

【技术实现步骤摘要】
用于侦测一目标核苷酸序列中之一特定区域的一突变和/或多态性的试剂盒
本专利技术系关于一种用于侦测一目标核苷酸序列中之一特定区域的一突变和/或多态性的试剂盒，且特别关于一种试剂盒，其用于侦测CYP2C9*2基因之rS1799853、CYP2C9*3 基因之 rsl057910、CYP4F2 基因之 rs2108622、VK0RCl_1639 基因之 rs9923231 或VKORCl 1173基因之rs9934438的单核苷酸多态性，其中此试剂盒适用于一聚合酶链式反应，特别是一环介导等温扩增(Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP) ?
技术介绍
目前已知CYP2C9 (细胞色素(cytochrome) P450,家族(family) 2,次家族(subfamily) C，多肽 9)基因(CYP2C9*2 (rsl799853)、CYP2C9*3 (rsl057910)、CYP4F2 (细胞色素(cytochrome)P450，家族4，次家族F，多肽2)基因(rs2108622)与VK0RC1 (维生素K环氧化物还原酶复合物(vitamin K epoxide reductase complex),亚基I)基因(VK0RCl-1639(rs9923231)、VKORCl 1173 (rs9934438))显著地影响对于药物华法令(warfarin)的维持剂量(maintenance dose) (Clinical Chemistry 55:4,804-812(2009);Blood.2008Apr15;111(8):4106-12.Epub 2008Feb 4.;Ann Clin LabSc1.201ISummer;41 (3):229_35)。在开此药方之前，可就病患之基因型来预先筛选病患适合之维持剂量，藉由较快的个人化测定，而将血栓性栓塞事件(thromboembolic episode)最小化。然而，若进行基因型鉴定以测定装载剂量(loading dose),可能会延迟治疗几小时至一天，因此需要更简单与迅速之基因型鉴定方法。环介导等温扩增(Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP)为聚合酶链式反应的一种特殊型式，为日本荣研公司(Eiken Genome Site)在2000年所研发出之新技术。此方法在60-65°C的恒温环境下，使用四条引物，于I小时内即可完成DNA或RNA的扩增反应。而由于环介导等温扩增具有所需的反应时间短、仅需简单之加热设备而不需专门仪器等优点，且灵敏度与专一性又相较于传统之聚合酶链式反应高出许多，又可以直接以肉眼辨识反应结果，因此非常适合应用于各种核酸检测，例如基因型鉴定。图1A与IB图解说明了环介导等温扩增的基本原理，而此方法的详细原理与操作说明，可参见美国专利号US 7，175，985B1与由日本荣研公司网站所提供之动画说明(http:/loopamp.eiken.c0.jp/e/lamp/anim.html)。由图1可知，环介导等温扩增在一目标基因100中选出了六个区域，分别为F1、F2、F3、Blc, B2c与B3c，而图1A与IB中显示于另一链中之Flc、F2c、F3c、B1、B2与B3区域则分别与上述F1、F2、F3、Blc, B2c与B3c区域互补。于此方法中，所选出之Fl与Blc区域的至少一个必须包含所欲侦测之突变点或单核苷酸多态性位点(SNP位点)，而所采用之酶为BstDNA聚合酶，其可 于恒温进行扩增反应，并且在扩增时可把目标或模板DNA的双链结构打开。又于此方法中，采用四条引物，分别为经特殊设计之正向内引物(forward innerprimer, FIP) 101、正向外引物(forward outer primer) 103、反向内引物(backward innerprimer, BIP) 105与反向外引物(backward outer primer) 107,其中正向内引物101之序列为由一第一片段(所预期之Fl区域之序列的互补链，即所预期之Flc区域的序列)(例如，若预期目标基因之Fl区域为野生型之序列，则此第一片段之序列为野生型Fl区域的互补链，相对地，若预期目标基因之Fl区域为突变型之序列，则此第一片段之序列为突变型Fl区域的互补链)与一第二片段(F2区域之序列)所组成，正向外引物103之序列为F3区域之序列，而反向内引物105之序列为由为由一第三片段(所预期之Blc区域之序列，即所预期之BI区域之序列的互补链)(例如，若预期目标基因之Blc区域为野生型之序列，则此第三片段之序列为野生型Blc区域之序列，相对地，若预期目标基因之Blc区域为突变型之序列，则此第三片段之序列为突变型Blc区域之序列)与一第四片段(B2c区域之序列的互补链，即B2区域之序列)所组成，反向外引物107之序列为B3c区域之序列的互补链(即B3区域之序列)。在环介导等温扩增进行中，正向内引物101之第二片段(F2区域之序列)会黏附于上述目标基因之另一链的F2c区域而进行互补链合成反应，而合成出具有第一片段(所预期之Fl区域之序列的互补链，即所预期之Flc区域的序列)、第二片段(F2区域之序列)、FU Blc, B2c与B3c区域之序列的一第一链，又正向外引物103会将此链移开，另合成出具有F3、F2、Fl、Blc、B2c与B3c区域之序列的一第二链。接着，反向内引物(backward innerprimer, BIP) 105之第四片段(B2区域之序列)黏附于上述第一链之B2c区域，并以此第一链为模板而合成出具有所预期之Blc、B2、Bl、Flc、F2c与所预期之Fl区域之序列的一第三链。之后，反向外引物107会将此第三链移开，另合成出具有B3、B2、Bl、Flc、F2c与所预期之Fl区域之序列的一第四链。而上述第三链之所预期之Blc与BI之间会产生自身黏附，且同样地，所预期之Fl与Flc之间也会会产生自身黏附，因此使第三链成为两端皆形成有茎环(loop)的一链。然后正向 内引物与反向内引物依序依照此链和/或其互补链合成产物为模板持续进行互补链合成反应，而形成一具有复数个茎环之双链产物(再次参见图1)。又图2A显示，在进行环介导等温扩增期间，当所预期之Fl区域的序列和所预期之Blc区域的序列分别与目标基因之Fl区域与Blc区域相同时所产生的结果。当所预期之Fl区域的序列和所预期之Blc区域的序列分别与目标基因之Fl区域与Blc区域相同时，则由于所合成出之前方段落所述之具有所预期之Blc、B2、Bl、Flc、F2c与所预期之Fl区域之序列的第三链可形成两端皆形成有茎环的一链，因此可持续进行互补链合成反应。而相对地，图2B显示，在进行环介导等温扩增期间，当所预期之Fl区域的序列和所预期之Blc区域的序列分别与目标基因之Fl区域与Blc区域不相同所产生的结果。当所预期之Fl区域的序列和所预期之Blc区域的序列分别与目标基因之Fl区域与Blc区域不同时，则由于合成出之具有所预期之Blc、B2、B1、Flc、F2c与所预期之Fl区域之序列的第三链，而其所预期之本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于侦测一目标核苷酸序列中之一特定区域的一突变和/或多态性的试剂盒，包括：至少一第一引物，系由一第一片段与一第二片段所组成，该第一片段之3’端连接该第二片段之5’端，其中该第一片段系为一第一序列之互补链，且具有约10?30个核苷酸，而该第一序列系位于序列辨识号：3之第375个位置至第406个位置之间，且必须包含第401个位置，又该第二片段系为一第二序列，且具有约10?30个核苷酸，而该第二序列系位于序列辨识号：3之第320个位置至第348个位置之间，一第二引物，其中该第二引物系为一第三序列，且具有约10?30个核苷酸，而该第三序列系位于序列辨识号：3之第298个位置至第328个位置之间；至少一第三引物，系由一第三片段与一第四片段所组成，该第三片段之3’端连接该第四片段之5’端，其中该第三片段系为一第四序列，且具有约10?30个核苷酸，而该第四序列系位于序列辨识号：3之第396个位置至第428个位置之间，且必须包含第401个位置，又该第四片段系为一第五序列之互补链，且具有约10?30个核苷酸，而该第五序列系位于序列辨识号：3之第451个位置至第479个位置之间；以及一第四引物，其中该第四引物系为一第六序列之互补链，且具有约10?30个核苷酸，而该第六序列系位于序列辨识号：3之第482 个位置至第514个位置之间；其中该试剂盒系用于侦测来自一个体之样本中之一目标基因中之一特定区域的一突变和/或多态性，该目标基因为CYP2C9（序列辨识号：1），而该特定区域为CYP2C9*2(rs1799853)，而该突变或和/或多态性之发生位置位于序列辨识号：1之第8633个位置，又其中该试剂盒系使用于一聚合酶链式反应中。...

【技术特征摘要】
2012.08.09 TW 1011287211.一种用于侦测一目标核苷酸序列中之一特定区域的一突变和/或多态性的试剂盒，包括: 至少一第一引物，系由一第一片段与一第二片段所组成，该第一片段之3’端连接该第二片段之5’端， 其中该第一片段系为一第一序列之互补链，且具有约10-30个核苷酸，而该第一序列系位于序列辨识号:3之第375个位置至第406个位置之间，且必须包含第401个位置，又该第二片段系为一第二序列，且具有约10-30个核苷酸，而该第二序列系位于序列辨识号:3之第320个位置至第348个位置之间， 一第二引物，其中该第二引物系为一第三序列，且具有约10-30个核苷酸，而该第三序列系位于序列辨识号:3之第298个位置至第328个位置之间； 至少一第三引物，系由一第三片段与一第四片段所组成，该第三片段之3’端连接该第四片段之5’端， 其中该第三片段系为一第四序列，且具有约10-30个核苷酸，而该第四序列系位于序列辨识号:3之第396个位置至第428个位置之间，且必须包含第401个位置，又该第四片段系为一第五序列之互补链，且具有约10-30个核苷酸，而该第五序列系位于序列辨识号:3之第451个位置至第479个位置之间；以及 一第四引物，其中该第四引物系为一第六序列之互补链，且具有约10-30个核苷酸，而该第六序列系位于序列辨识号:3之第482个位置至第514个位置之间； 其中该试剂盒系用于侦测来自一个体之样本中之一目标基因中之一特定区域的一突变和/或多态性，该目标基因为CYP2C9 (序列辨识号:1)，而该特定区域为CYP2C9*2 (rsl799853)，而该突变或和/或多态性之发生位置位于序列辨识号:1之第8633个位置， 又其中该试剂盒系使用于一聚合酶链式反应中。2.如权利要求1所述之用于侦测一目标核苷酸序列中之一特定区域的一突变和/或多态性的试剂盒，其中该至少一第一引物包括序列为序列辨识号:16之引物和/或序列为序列辨识号:17之引物，该第二引物为序列辨识号:18、该至少一第三引物包括序列为序列辨识号:21之引物和/或序列为序列辨识号:22之引物，而该第四引物为序列为序列辨识号23之引物。3.如权利要求1所述之用于侦测一目标核苷酸序列中之一特定区域的一突变和/或多态性的试剂盒，其中该至少一第一引物包括序列为序列辨识号:16之引物，该第二引物为序列辨识号:18、该至少一第三引物包括序列为序列辨识号:21之引物，而该第四引物为序列为序列辨识号23之引物。4.如权利要求1所述之用于侦测一目标核苷酸序列中之一特定区域的一突变和/或多态性的试剂盒，其中该至少一第一引物包括序列为序列辨识号:17之引物，该第二引物为序列辨识号:18、该至少一第三引物包括序列为序列辨识号:22之引物，而该第四引物为序列为序列辨识号23之引物。5.如权利要求1所述之用于侦测一目标核苷酸序列中之一特定区域的一突变和/或多态性的试剂盒，更包括: 一 DNA聚合酶，其催化包含一链置换之互补链合成；以及核苷酸底物。6.如权利要求1所述之用于侦测一目标核苷酸序列中之一特定区域的一突变和/或多态性的试剂盒，其中该聚合酶链式反应包括一环介导等温扩增(Loop-mediatedIsothermal Amplification, LAMP)。7.一种用于侦测一目标核苷酸序列中之一特定区域的一突变和/或多态性的试剂盒，包括: 至少一第一引物，系由一第一片段与一第二片段所组成，该第一片段之3’端连接该第二片段之5’端， 其中该第一片段系为一第一序列之互补链，且具有约10-30个核苷酸，而该第一序列系位于序列辨识号:25之第376个位置至第406个位置之间，且必须包含第401个位置，又该第二片段系为一第二序列，且具有约10-30个核苷酸，而该第二序列系位于序列辨识号:25之第332个位置至第359个位置之间， 一第二引物，其中该第二引物系为一第三序列，且具有约10-30个核苷酸，而该第三序列系位于序列辨识号:25之第301个位置至第328个位置之间； 至少一第三引物，系由一第三片段与一第四片段所组成，该第三片段之3’端连接该第四片段之5’端， 其中该第三片段系为一第四序列，且具有约10-30个核苷酸，而该第四序列系位于序列辨识号:25之第396个位置至第425个位置之间，且必须包含第401个位置，又该第四片段系为一第五序列之互补链，且具有约10-30个核苷酸，而该第五序列系位于序列辨识号:25之第448个位置至第478个位置之间；以及 一第四引物，其中该第四引物系为一第六序列之互补链，且具有约10-30个核苷酸，而该第六序列系位于序列辨识号:25之第470个位置至第501个位置之间； 其中该试剂盒系用于侦测来自一个体之样本中之一目标基因中之一特定区域的一突变和/或多态性，该目标基因为CYP2C9 (序列辨识号:1)，而该特定区域为CYP2C9*3 (rsl057910)，而该突变或和/或多态性之发生位置位于序列辨识号:1之第47639个位置， 又其中该试剂盒系使用于一聚合酶链式反应中。8.如权利要求7所述之用于侦测一目标核苷酸序列中之一特定区域的一突变和/或多态性的试剂盒，其中该至少一第一引物包括序列为序列辨识号:38之引物和/或序列为序列辨识号:39之引物，该第二引物为序列辨识号:40、该至少一第三引物包括序列为序列辨识号:43之引物和/或序列为序列辨识号:44之引物，而该第四引物为序列为序列辨识号45之引物。9.如权利要求7所述之用于侦测一目标核苷酸序列中之一特定区域的一突变和/或多态性的试剂盒，其中该至少一第一引物包括序列为序列辨识号:38之引物，该第二引物为序列辨识号:40、该至少一第三引物包括序列为序列辨识号:43之引物，而该第四引物为序列为序列辨识号45之引物。10.如权利要求7所述之用于侦测一目标核苷酸序列中之一特定区域的一突变和/或多态性的试剂盒，其中该至少一第一引物包括序列为序列辨识号:39之引物，该第二引物为序列辨识号:40、该至少一第三引物包括序列为序列辨识号:44之引物，而该第四引物为序列为序列辨识号45之引物。11.如权利要求7所述之用于侦测一目标核苷酸序列中之一特定区域的一突变和/或多态性的试剂盒，更包括: 一 DNA聚合酶，其催化包含一链置换之互补链合成；以及 核苷酸底物。12.如权利要求7所述之用于侦测一目标核苷酸序列中之一特定区域的一突变和/或多态性的试剂盒，其中该聚合酶链式反应包括一环介导等温扩增。13.一种用于侦测一目标核苷酸序列中之一特定区域的一突变和/或多态性的试剂盒，包括: 至少一第一引物，系由一第一片段与一第二片段所组成，该第一片段之3’端连接该第二片段之5’端， 其中该第一片段系为一第一序列之互补链，且具有约10-30个核苷酸，而该第一序列系位于序列辨识号:48之第393个位置至第423个位置之间，且必须包含第417个位置，又该第二片段系为一第二序列，且具有约10-30个核苷酸，而该第二序列系位于序列辨识号:48之第352个位置至第381个位置之间； 一第二引物，其中该第二引物系为一第三序列，且具有约10-30个核苷酸，而该第三序列系位于序列辨识号:48之第333个位置至第358个位置之间； 至少一第三引物，系由一第三片段与一第四片段所组成，该第三片段之3’端连接该第四片段之5’端， 其中该第三片段系为一第四序列，且具有约10-30个核苷酸，而该第四序列系位于序列辨识号:48之第411个位置至第444个位置之间，且必须包含第417个位置，又该第四片段系为一第五序列之互补链，且具有约10-30个核苷酸，而该第五序列系位于序列辨识号:48之第460个位置至第488个位置之间； 一第四引物，其中该第四引物系为一第六序列之互补链，且具有约10-30个核苷酸，而该第六序列系位于序列辨识号:48之第492个位置至第519个位置之间；以及 其中该试剂盒系用于侦测来自一个体之样本中之一目标基因中之一特定区域的一突变和/或多态性，该目标基因为CYP4F2 (序列辨识号:46)，而该特定区域为rs2108622，而该突变或和/或多态性之发生位置位于序列辨识号:46之第23454个位置， 又其中该试剂盒系使用于一聚合酶链式反应中...

【专利技术属性】
技术研发人员：江佩馨，吴姿慧，陈嘉钧，李淑贞，陈建安，徐建明，廖中衙，林昱宇，
申请(专利权)人：财团法人工业技术研究院，
类型：发明
国别省市：