一种β-胡萝卜素降解酶的纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种β-胡萝卜素降解酶的纯化方法，该方法首先在改良查氏培养基中培养产β-胡萝卜素降解酶的葡萄球菌，培养24h，10000r?min-1离心20min取上清得到粗酶液，采用冷冻干燥将粗酶液浓缩，用于纯化。该方法采用蛋白纯化系统（AKTA?purifier100system）和高效制备液相（PHPLC）相结合的方式纯化β-胡萝卜素降解酶，并通过HPLC检测酶纯度，能快速的纯化得到纯度达95%的纯酶。该发明专利技术前处理较为简单易行，纯化过程稳定，重复性高，可得到大量纯酶，为其在工业上用于降解β-胡萝卜素产香奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，该方法首先在改良查氏培养基中培养产β-胡萝卜素降解酶的葡萄球菌，培养24h，10000r?min-1离心20min取上清得到粗酶液，采用冷冻干燥将粗酶液浓缩，用于纯化。该方法采用蛋白纯化系统（AKTA?purifier100system）和高效制备液相（PHPLC）相结合的方式纯化β-胡萝卜素降解酶，并通过HPLC检测酶纯度，能快速的纯化得到纯度达95%的纯酶。该专利技术前处理较为简单易行，纯化过程稳定，重复性高，可得到大量纯酶，为其在工业上用于降解β-胡萝卜素产香奠定基础。【专利说明】—种β-胡萝卜素降解酶的纯化方法
本专利技术属于食品生物
，涉及一种化合物的纯化方法，特别涉及。
技术介绍
香气是各类食品的重要特征之一，香气的种类、含量是衡量食品质量的重要依据，在很大程度上决定人们对食品的喜好。降异戊二烯化合物广泛存在于果酒、水果及烟草中，是对食品香气品质具有重要影响的化合物。降异戊二烯香气化合物一般含有13个碳原子，这一类香气化合物的典型代表是紫罗兰酮和大马酮，因其具有特殊的香气，在食品、发酵酒、香料、烟草等行业占有重要地位。类胡萝卜素是降异戊二烯香气化合物的前体物，由于其经济实用，已大量用于生产降异戊二烯化合物。类胡萝卜素经过分解(裂解)能够产生降异戊二烯化合物，极大地丰富产品的风味和香气，特别对酿造类食品如果酒的香味贡献极大，可以大大提升果酒的香味和品质，因此，研究类胡萝卜素的生物降解产香有重要的现实意义和巨大的应用前景。微生物产香是目前国际上改进香料生产技术和改善发酵食品香气品质的新型研究领域，但目前的研究水平大多还停留在产香微生物筛选及产香特征的研究，关于类胡萝卜素降解酶的研究报道也大多来自植物源降解酶，而且集中在异源表达酶的纯化和粗酶的简单纯化(通过等电点)，关于微生物酶的研究极少，而关于纯化类胡萝卜素降解酶的方法也很少。利用微生物酶进行生产可有效简化生产工艺，降低生产成本；类胡萝卜素降解酶更容易作为食品调香助剂在食品生产中得到广泛应用。但广泛应用微生物酶的前提是能得到廉价且具有一定数量的酶。现有研究表明，大多数具有类胡萝卜素降解能力的微生物产生降解酶的能力较差，酶的产量十分低，从微生物培养物中分离纯化一定数量且能用于生产的酶难度极大，成本极高。`
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种β_胡萝卜素降解酶的纯化方法，该方法对样品的前处理简单，操作方便，可重复性高，能得到纯度达95%的纯酶。为了实现上述任务，本专利技术采取如下的技术解决方案:一种β_胡萝卜素降解酶的纯化方法，其特征在于，该方法采用蛋白纯化系统和高效液相色谱法对β_胡萝卜素降解酶进行纯化，利用高效液相色谱法对其纯度进行鉴定，并算出该酶纯化每一步的酶活和比活力，具体按下列步骤操作:I)在改良查氏培养基(液体查氏培养基中添加0.3%的酵母浸粉)中培养葡萄球菌，培养条件为:37°C，恒温培养24h ；2)培养结束后，将发酵液于1000Or mirT1冷冻离心20min，取上清得粗酶液，冷冻、干燥、浓缩粗酶液至规定的浓度，取浓缩液过0.22 μ m有机系滤膜，得上样:3)纯化:纯化分三步:第一步是离子交换，上样于蛋白纯化系统，条件:强阴离子柱MONO Q10/100GL，选择合适的缓冲液进行线性洗脱，选择三个波长同时检测，收集具有降解β_胡萝卜素能力的活性成分；第二步，将上述得到的活性成分进高效液相色谱进行进一步分离，纯化条件:半制备色谱柱C18，选择合适柱温，以及合适流动相进行梯度洗脱，选择相应波长检测，将具有降解β -胡萝卜素能力的活性峰收集，冷冻干燥浓缩；第三步，上样于蛋白纯化系统，条件:多肽分子筛Superdex peptide10/300COlumn，选择合适的缓冲液洗脱，选择三个波长同时检测，收集目标峰，浓缩，重新上样于多肽 分子筛，同样的条件再次纯化收集目标峰，浓缩进HPLC进行检测；采用分析液相检测纯度的条件:色谱柱C18，选择合适的柱温及其合适的流动相洗脱，选择相应的波长检测；将底物β_胡萝卜素配制成胡萝卜素储备液，并建立胡萝卜素溶液浓度与吸光值的标准曲线，用以计算β_胡萝卜素降解酶的酶活和比活力。上述改良查氏培养基是在查氏培养基加入质量浓度为0.3%酵母浸粉，以适应巴氏葡萄球菌的生长。上述离子交换中的缓冲液为:A液:20mM醋酸钠-醋酸溶液(ρΗ5.0), B液:20mM醋酸钠缓冲液中加Imol 1-1氯化钠；所述线性洗脱为:上样量为2ml ;流速lml/min ;洗脱程序为:0-30min, A 液洗脱；30_70min，0-50%B 液线性洗脱；70_80min，50%B 液洗脱；80-110min, 100%B 液洗脱；检测波长为 280nm，254nm 和 215nm。上述制备液相的流动相为:A液:20mM醋酸钠-醋酸溶液(pH5.0), B液:乙腈；所述梯度洗脱为:上样量5ml ;流速5ml mirT1 ;洗脱程序为:初始流动相A:B的比例为77.5:12.5,20min时，流动相A:B的比例为50:50,25min时，流动相A:B的比例为40:60，35min时，为100%B液，40min时，流动相A:B的比例为77.5:12.5，柱温30°C，检测波长为280nm,254nm 和 215nm。上述多肽分子筛的缓冲液为蒸馏水；上样量500 μ I ;流速0.5ml mirT1 ;检测波长为 280nm，254nm 和 215nm ;检测时间为 70min。上述分析液相的流动相为A液:20mM醋酸钠-醋酸溶液(pH5.0)，B液:乙腈；上样量20μ I ;流速lml/min ;检测波长为280nm，254nm和215nm ;柱温:30°C ;检测时间为lOmin。上述标准曲线的建立为:首先准确称取5mgP -胡萝卜素标准品，溶解于IOml的二氯甲烧，并加入Ig的Tween-80,在通风橱中旋转使其二氯甲烧挥发至干,加入50ml蒸懼水即为胡萝卜素储备液于4°C保存；分别取20，40，60，80，10(^1储备液定容至3.251111，以蒸馏水为空白调零于460nm波长处测其吸光值，用所得数据作图可得β -胡萝卜素溶液浓度与吸光值的标准曲线。上述计算β -胡萝卜素降解酶的酶活，根据胡萝卜素初始浓度和加入胡萝卜素降解酶反应10min后胡萝卜素的终浓度得到的。酶活定义为:lmin降解IumoL底物所需要的酶液为一个酶活单位，即1U。本专利技术的β -胡萝卜素降解酶的纯化方法，所带来的技术效果是:1、在查氏培养基培养葡萄球菌过程中加入酵母浸粉，使其产生活性更高的粗酶，以便纯化过程的进行。2、采用强离子交换柱MONO Q10/100GL( 10 X 100mm)纯化蛋白，缓冲液为A液:20mM醋酸钠-醋酸溶液(PH5.0), B液:20mM醋酸钠缓冲液中加Imol I-1氯化钠；所述线性洗脱为:上样量为2ml ;流速lml/min ;程序为:0_30min，A液洗脱；30_70min，0_50%B液线性洗脱；70-80min，50%B 液洗脱；80_110min，100%B 液洗脱；检测波长为 280nm，254nm 和 215nm。能较好的除去多种杂蛋白。3、采用半制备本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种β?胡萝卜素降解酶的纯化方法，其特征在于，该方法采用蛋白纯化系统和高效液相色谱法对β?胡萝卜素降解酶进行纯化，利用高效液相色谱法对其纯度进行鉴定，并算出该酶纯化每一步的酶活和比活力，具体按下列步骤操作：1）在改良查氏培养基中培养葡萄球菌，培养条件为：37℃，恒温培养24h；2）培养结束后，将发酵液于10000r?min?14℃离心20min，取上清得粗酶液，冷冻、干燥、浓缩粗酶液至规定的浓度，取浓缩液过0.22μm有机系滤膜，过滤液用于进一步纯化酶；3）纯化：纯化分三步：第一步是离子交换，上样于蛋白纯化系统，条件：强阴离子柱MONO?Q10/100GL，选择合适的缓冲液进行线性洗脱，选择三个波长同时检测，收集具有降解β?胡萝卜素能力的活性成分；第二步，将上述得到的活性成分进高效液相色谱进行进一步分离，纯化条件：半制备色谱柱C18，选择合适柱温，以及合适流动相进行梯度洗脱，选择相应波长检测，将具有降解β?胡萝卜素能力的活性峰收集，冷冻干燥浓缩；第三步，上样于蛋白纯化系统，条件：多肽分子筛Superdex?peptide10/300column，选择合适的缓冲液洗脱，选择三个波长同时检测，收集目标峰，浓缩，重新上样于多肽分子筛，同样的条件再次纯化收集目标峰，浓缩进HPLC进行检测；采用分析液相检测纯度的条件：色谱柱C18，选择合适的柱温及其合适的流动相洗脱，选择相应的波长检测；将底物β?胡萝卜素配制成胡萝卜素储备液，并建立β?胡萝卜素溶液浓 度与吸光值的标准曲线，用以计算β?胡萝卜素降解酶的酶活和比活力。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：樊明涛，朱明明，王树林，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：