本发明专利技术涉及基因工程领域，具体地，涉及一种热稳定性改良的碱性木聚糖酶及其编码基因和应用。本发明专利技术以Bacillus?subtillis?B230木聚糖酶xyn-B230的晶体结构为出发的结构，选择的突变位点为S23H和I129Y。与木聚糖酶xyn-B230相比，突变后的酶的热稳定性得到了明显的提高，在70℃保温120min仍能保留90%的酶活性。在75℃处理30min酶活性仍然能保持65%以上的活性。木聚糖酶xyn-B230-m具有比较好的性质，可以满足在造纸行业的使用。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及基因工程领域，具体地，涉及一种热稳定性改良的碱性木聚糖酶及其编码基因和应用。本专利技术以Bacillus?subtillis?B230木聚糖酶xyn-B230的晶体结构为出发的结构，选择的突变位点为S23H和I129Y。与木聚糖酶xyn-B230相比，突变后的酶的热稳定性得到了明显的提高，在70℃保温120min仍能保留90%的酶活性。在75℃处理30min酶活性仍然能保持65%以上的活性。木聚糖酶xyn-B230-m具有比较好的性质，可以满足在造纸行业的使用。【专利说明】一种热稳定性改良的碱性木聚糖酶及其编码基因和应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体地，涉及一种热稳定性改良的碱性木聚糖酶及其编码基因和应用。
技术介绍
木聚糖是植物半纤维素的重要成份，是陆生植物细胞壁中最普通的半纤维素，除纤维素外，木聚糖是自然界中最丰富的多糖。在阔叶材和一年生禾本植物中木聚糖占植物原料干重的20%-30%，针叶材中木聚糖含量较少，一般为原料干重的7%-10%。木聚糖酶是降解半纤维素木聚糖的一组酶的总称，它主要包括作用于主链的内切-1，4-β-木聚糖酶和β-木糖苷酶以及其它辅酶。自从发现木聚糖酶可以用于纸浆的漂白以后，国内外对木聚糖酶研究和开发非常关注，它可以应用于生物制浆、纸浆漂白、废纸二次纤维回收、废纸脱墨处理及纸张表面处理等，特别是其在纸浆生物漂白中的巨大应用潜力早已引起各界同行的高度关注。无论是阔叶材还是针叶材硫酸盐浆及其它化学浆；无论是与传统的氯漂序相配合还是与先进的无氯漂序相配合，采用木聚糖酶处理均可以促使纸浆中残余木质素的降解和溶解性木质素的抽除，不但可以提高纸浆的白度和白度稳定性，改善纤维的滤水性和造纸性 能，而且可大大减少后续漂白过程中氯化物的用量，从而大大降低制浆和造纸工业对环境造成的污染。和其它的酶制剂不同，用于造纸上的酶制剂，需要经历一个高温强碱的处理过程，因为制浆过程是在碱性的条件下，用高温蒸煮的方法除去木屑中的木质素。因此，用于纸浆漂白的木聚糖酶应是耐热和耐碱的。而到目前为止，工业上用于纸浆漂白的木聚糖酶大多是中性偏酸的，最适反应温度大多在45°C以下，这就要求在加酶之前先将纸浆的pH和温度调到适合木聚糖酶作用的范围，这是一个费时和费力的过程。要解决以上问题，就需要获得适合在造纸工业条件下使用的耐热和耐碱的木聚糖酶。要获得特殊性质的木聚糖酶，可以考虑从以下几个方面展开工作:首先，可以从极端环境中分离具有嗜极微生物菌种，并从中克隆耐热耐碱的木聚糖酶。同时，还要积极加强包括传统微生物育种在内的诱变育种和分子育种，不断提升菌种木聚糖酶基因的表达量和产品的性能。其次，通过基因工程和蛋白质工程等现代生物技术手段对木聚糖酶基因进行分子改造，提高木聚糖酶的稳定性和对不良外界条件的抗逆性，筛选出符合不同应用领域要求的木聚糖酶基因。因此提高该木聚糖酶的热稳定性，使其能够有效地在各领域上获得更好的应用。目前通过蛋白质工程的手段在酶分子改造方面已经有很多成功的例子，特别是在提高酶的热稳定性。定点突变即理性设计是在已知酶的结构与功能的基础上有目的、有针对性地改变酶的某一活性基团或模块，最终获得特定氨基酸残基得具有性质得到预期改变的蛋白质，该技术已被广泛用于酶分子的改造。本专利技术以目前在纸浆和造纸上已经使用的来源于芽孢杆菌的木聚糖酶xyn-B230为出发材料，通过系列定点突变，最终得到了一个热稳定性提高的木聚糖酶xyn-B230-m。与木聚糖酶xyn-B230相比，突变后的酶的热稳定性得到了明显的提高，在70°C保温120min仍能保留90%的酶活性。在75°C处理30min酶活性仍然能保持65%以上的活性。木聚糖酶xyn-B230-m具有比较好的性质，可以满足在造纸行业的使用。
技术实现思路
本专利技术的目的是通过对来源于芽孢杆菌的木聚糖酶xyn-B230的改造，使改造后的木聚糖酶xyn-B230-m在高温时稳定性提高，使其能够更好在高温强碱性的纸浆生物漂白中发挥降解原料中木聚糖的作用，促使纸浆中残余木质素的更好降解和溶解性木质素的抽除。本专利技术的目的是提供一种优化改良的木聚糖酶xyn-B230_m本专利技术的再一目的是提供优化改良的木聚糖酶基因。本专利技术的再一目的是提供包含上述的木聚糖酶基因的重组载体。本专利技术的再一目的是提供包含上述的木聚糖酶基因的重组菌株。本专利技术的再一目的是提供上述木聚糖酶xyn-B230_m的应用。以Bacillus subtillis B230 木聚糖酶 xyn_B230 的晶体结构(PDB:1IG0)为出发的结构，选择的突变位点，为了提高来源于芽孢杆菌的木聚糖酶xyn-B230的热稳定性，利用生物计算和蛋白质工程手段对xyn-B230中可能影响其热稳定性的关键氨基酸进行了突变研究，这些氨基酸分别是第23位的S突变为H、第45位的N突变为1、第55位的D突变为P、第60位的H突变为Y、第61位的S突变为D、第65位的N突变为D、第75位的N突变为T、第129位的I突变为Y、第149位的T突变为D、第185位的Y突变为F，以及进一步对热稳定性有所提高的第23位的S突变为H和第129位的I突变为Y，进行组合突变。最后经过优化改良的木聚糖酶xyn-B230-m在75°C的热稳定性得到了明显的提高，可在造纸应用中显示出巨大的应用潜力。通过对每个突变体进行酶学性质的分析，最终获得了热稳定性明显提高的木聚糖酶xyn-B230-m。本专利技术的木聚糖酶xyn-B230_m和原有芽孢杆菌木聚糖酶xyn_B230相比，有两个氨基酸发生了突变，突变位点为S23H和I129Y (突变位点以斜体和下划线标示)。突变后的氨基酸序列(不包括信号肽序列)如SEQ ID N0.1所示:ATTlTSNQTGTHDGYDYELffKDHGNTSMTLNSGGAFSAQffSNIGNALFRKGKKF DSTKTHSQLGNISINYNATFNPGGNSYLCVYGWTKDPLTEYYIVDNWGTYRPTGT PKGTFTVDGGTYDIYETTRYNQPSIIGIATFKQYffSVRQTKRTSGTVSVSEHFKKff ESLGMPMGKMYETALTVEGYQSNGSANVTANVLTIGGKPLAA本专利技术还提供了上述改良的耐高温木聚糖酶xyn-B230-m的基因序列，其碱基序列如SEQ ID N0.2所示:gctaccaccatcacatctaatcagacaggaacacacgacggttatgactatgaactttggaaggaccatggaaacacctctatgac tttgaactctggtggagctttttcagcccaatggagtaacattggtaacgcattgtttagaaagggaaagaaattcgattctaccaaaa ctcattcccagcttggtaacatctctatcaactacaacgctactttcaacccaggtggaaattcctacttgtgtgtttatggttggacaa aggatcctcttaccgaatactatattgtcgacaactggggaacttatagaccaacaggtacccctaaaggaacttttacagttg本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种热稳定性改良的木聚糖酶突变体xyn?B230?m，其特征在于，对氨基酸序列如SEQ?ID?No.3所示的木聚糖酶进行S23H和I129Y突变，获得所述热稳定性改良的木聚糖酶突变体xyn?B230?m。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：姚斌，黄火清，罗会颖，王亚茹，石鹏君，柏映国，孟昆，杨培龙，
申请(专利权)人：中国农业科学院饲料研究所，
类型：发明
国别省市：
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