奶山羊冷冻精液稀释液及其制备方法和稀释方法、以及奶山羊冷冻精液细管冻精的制备方法技术

本发明专利技术涉及奶山羊冷冻精液稀释液及其制备方法和稀释方法、以及奶山羊冷冻精液细管冻精的制备方法。现有冷冻精液保存方法，精子受低温打击致使质膜结构改变，严重影响质膜的完整性及其复苏后的活率及受精能力。本发明专利技术对新鲜精液进行两步稀释、平衡及两步降温细管冷冻处理，其中，基础稀释液由Tris、柠檬酸、葡萄糖、海藻糖、Vc、GSH、BSA、ATP、复合抗生素、卵黄加水配成，冷冻稀释液由基础稀释液加甘油配成；利用稀释液对鲜精进行稀释和平衡后，分装于细管，储存于液氮中。本发明专利技术对奶山羊精液低温保存和冷冻保存具有良好效果，有效提高解冻后活率、顶体完整率及质膜完整性，降低畸形率，提高奶山羊冻精生产效率及冻精品质。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及。现有冷冻精液保存方法，精子受低温打击致使质膜结构改变，严重影响质膜的完整性及其复苏后的活率及受精能力。本专利技术对新鲜精液进行两步稀释、平衡及两步降温细管冷冻处理，其中，基础稀释液由Tris、柠檬酸、葡萄糖、海藻糖、Vc、GSH、BSA、ATP、复合抗生素、卵黄加水配成，冷冻稀释液由基础稀释液加甘油配成；利用稀释液对鲜精进行稀释和平衡后，分装于细管，储存于液氮中。本专利技术对奶山羊精液低温保存和冷冻保存具有良好效果，有效提高解冻后活率、顶体完整率及质膜完整性，降低畸形率，提高奶山羊冻精生产效率及冻精品质。【专利说明】
本专利技术涉及生物
，具体涉及。
技术介绍
奶山羊作为重要的奶畜资源，近些年来随着我国国民生活水平提高及饮食结构调整而倍受重视。奶山羊养殖主要集中在陕西、山东、河南、河北、云南等省份，然而羊奶的需求目前已经遍及东部沿海及南方港、澳、台等10多个省、市、自治区及直辖市，体现出一种供不应求的趋势，因此如何加快奶山羊品种改良，提高奶山羊良种繁育速度及建立规模化养殖管理体系成为目前工作的重中之重。精液冷冻保存与人工受精技术在现代化畜牧业生产中发挥着举足轻重的作用，应用冷冻精液进行人工授精可以不受时间、地域、品种及个体的限制，并且大量减少公畜的饲养数量，降低生产成本，提高优良种公畜的利用率，提高养殖业的经济效益。同时该技术对品种引进、杂交改良，以及提高繁殖性能、疾病控制及保护遗传多样性保护方面也具有重要的意义。我国在奶牛及肉牛上应用冷冻精液技术及人工授精技术已发展的较为完善，充分提高了养殖的经济效益，但在山羊精液冷冻保存及人工授精技术上尽管已经应用多年，但普遍冷冻精液解冻后，精子活率(0.3-0.5)难以提高受胎率(35%-50%)满足规模化生产需要。其原因是精子受低温打击致使精子质膜结构发生改变，严重影响质膜的完整性及其复苏后的精子的活率及受精能力。因此只有深入了解稀释液中各成分的用途与作用机理，选择适合羊精液的成分才能使其发挥有效作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，能够有效改善精子在降温过程中所受到的损伤，保持精子完整性，减少精子在冷冻过 程中所受到的伤害。本专利技术所采用的技术方案是:奶山羊冷冻精液基础稀释液的制备方法，其特征在于:由以下步骤实现:步骤一:按以下比例准备各组分:三羟甲基-氨基甲烷 300-400 mM ；100-130 mM ；35-45 mM ；260-300 mM ；4-6 g/L ；4-6 mM ；8-12 g/L ；柠檬酸葡萄糖海藻糖维生素C还原型谷胱甘肽牛血清白蛋白三磷酸腺苷0.7-1.5 mM ；步骤二:将上述组分与双蒸水按比例混匀后，0.2 um滤膜过滤，加入复合抗生素；步骤三:按体积比15-25 %的比例，在步骤二得到的混合液中加入卵黄添加液，充分混匀，得到基础稀释液。步骤二中，加入复合抗生素，即加入0.05~0.055 g/L的泰乐菌素、0.27~0.28 g/L的庆大霉素、0.16^0.18 g/L的林可霉素以及0.3^0.35 g/L的奇霉素。步骤三中，卵黄添加液由以下步骤制得:将新鲜无病原菌鸡蛋经过双氯苯双胍己烷浸泡后抽取卵黄液，以质量体积比为0.035%加入十二烷基磺酸钠，15 X IO3 g离心I h，吸取上清液经0.45 μ m滤膜过滤得到卵黄添加液。所述的制备方法制得的奶山羊冷冻精液基础稀释液。奶山羊冷冻精液冷冻稀释液的制备方法，其特征在于:由以下步骤实现:步骤一:按以下比例准备各组分:三羟甲基-氨基甲烷 300-400 mM ；100-130 mM ；35-45 mM ；260-300 mM ；4-6 g/L ；4-6 mM ；8-12 g/L ；0.7-1.5 mM ；步骤二:将上述组分与双蒸水按比例混匀后，0.2 um滤膜过滤，加入复合抗生素；步骤三:按体积比15-25 %的比例，在步骤二得到的混合液中加入卵黄添加液，充分混匀，得到基础稀释液；步骤四:基础稀释液配制好后，按甘油终体积浓度为12-16%的比例，加入甘油，得到冷冻稀释液。步骤二中，加入复合抗生素，即加入0.05~0.055 g/L的泰乐菌素、0.27~0.28 g/L的庆大霉素、0.16^0.18 g/L的林可霉素以及0.3^0.35 g/L的奇霉素。步骤三中，卵黄添加液由以下步骤制得:将新鲜无病原菌鸡蛋经过双氯苯双胍己烷浸泡后抽取卵黄液，以质量体积比为0.035%加入十二烷基磺酸钠，15 X IO3 g离心I h，吸取上清液经0.45 μ m滤膜过滤得到卵黄添加液。所述的制备方法制得的奶山羊冷冻精液冷冻稀释液。奶山羊冷冻精液的稀释方法，其特征在于:由以下步骤实现:步骤一:制备基础稀释液:(I)按以下比例准备各组分:三羟甲基-氨基甲烷 300-400 mM ；柠檬酸葡萄糖海藻糖维生素C还原型谷胱甘肽牛血清白蛋白三磷酸腺苷柠檬酸葡萄糖海藻糖维生素C100-130 mM ；35—45 mM ；260-300 mM ；还原型谷胱甘肽牛血清白蛋白三磷酸腺苷4-6 mM ；8-12 g/L ；0.7-1.5 mM ；(2)将上述组分与双蒸水按比例混匀后，0.2 um滤膜过滤，加入复合抗生素，即加入0.05、.055 g/L的泰乐菌素、0.27、.28 g/L的庆大霉素、0.16^0.18 g/L的林可霉素以及0.3~0.35 g/L的奇霉素；(3)按体积比15-25%的比例，在步骤二得到的混合液中加入卵黄添加液，充分混匀，得到基础稀释液；卵黄添加液由以下步骤制得:将新鲜无病原菌鸡蛋经过双氯苯双胍己烷浸泡后抽取卵黄液，以质量体积比为0.035%加入十二烷基磺酸钠，15 X IO3 g离心I h，吸取上清液经0.45 μ m滤膜过滤得到卵黄添加液；步骤二:制备冷冻稀释液:基础稀释液配制好后，按甘油终体积浓度为12-16%的比例，加入甘油，得到冷冻稀释液；步骤三:采用两步法稀释奶山羊精液并平衡:(1)采集新鲜公羊精液，在37°C温度下对精子的表观活率、活率及密度进行质量评定:用带有刻度的集精杯计算每次采精体积；在显微镜100倍视野下观察鲜精的表观活率，分为0-5级，O级为没有波动，5级为快速漩涡状波动；在400倍视野下评定鲜精活率，将鲜精稀释1000倍后在血球计数板上计算精液密度；只有精液表观活率为5级，活率大于0.8且密度大于2.0X IO9个/mL才能用于冷冻精液制作；(2)等温加入基础稀释液，使稀释后精子密度为8XIO8 -1OXlO8个/mL，基础稀释液添加量为鲜精液的3-6倍，混匀后转移至冰箱冷藏室或4°C低温环境，1.5-2 h水浴冷却到0-4°C完成第一步稀释；(3)在相同温度下以体积比1:1加入冷冻稀释液并混匀，此时混合精液密度为4X108-5 X IO8个/mL，甘油浓度为6-8 %，完成第二步稀释，平衡时间2_6 h。奶山羊冷冻 精液细管冻精的制备方法，其特征在于:由以下两步降温法实现:步骤一:制备基础稀释液:(I)按以下比例准备各组分:三羟甲基-氨基甲烷 300-400 mM ；柠檬酸100-130 mM ；葡萄糖35-45 mM ；海藻糖260-300 mM ；维生素C4-6 g/L ；还原型谷胱甘肽4-6 mM ；牛血清本文档来自技高网...

【技术保护点】
奶山羊冷冻精液基础稀释液的制备方法，其特征在于：由以下步骤实现：步骤一：按以下比例准备各组分：三羟甲基?氨基甲烷????300?400?mM；柠檬酸????100?130?mM；葡萄糖????35?45?mM；海藻糖????260?300?mM；维生素C????4?6?g/L；还原型谷胱甘肽????4?6?mM；牛血清白蛋白????8?12?g/L；三磷酸腺苷????0.7?1.5?mM；步骤二：将上述组分与双蒸水按比例混匀后，0.2?um滤膜过滤，加入复合抗生素；步骤三：按体积比15?25?%的比例，在步骤二得到的混合液中加入卵黄添加液，充分混匀，得到基础稀释液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王维，罗军，史怀平，席利萌，孙爽，高庆华，张伟，杨地坤，朱江江，石恒波，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：