一种尿液中丙烯酰胺巯基尿酸代谢物的自动在线分析方法，是对N-乙酰-S-（2－氨基甲酰乙基）-L-巯基丙氨酸（AAMA）、N-乙酰-S-（2-氨基甲酰-2-羟基乙基）-L-巯基丙氨酸（GAMA）的HPLC-MS/MS的测定分析方法，其特征在于：尿样解冻后加入GAMA-d3、AAMA-d4内标，经混匀、离心后，直接进LC-MS/MS进行AAMA、GAMA定量分析，通过液相色谱柱的选择，六通阀转换时间的确定及流动相组成的优化，以乙腈与0.1%甲酸水溶液为流动相，采用四级杆串接质谱对主流烟气中的丙烯酰胺进行检测。通过本发明专利技术的在线分析方法，样品不用经任何前处理，操作简单，重复性和回收率好，适用于大批量样品的分析。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】一种，是对N-乙酰-S-（2－氨基甲酰乙基）-L-巯基丙氨酸（AAMA）、N-乙酰-S-（2-氨基甲酰-2-羟基乙基）-L-巯基丙氨酸（GAMA）的HPLC-MS/MS的测定分析方法，其特征在于：尿样解冻后加入GAMA-d3、AAMA-d4内标，经混匀、离心后，直接进LC-MS/MS进行AAMA、GAMA定量分析，通过液相色谱柱的选择，六通阀转换时间的确定及流动相组成的优化，以乙腈与0.1%甲酸水溶液为流动相，采用四级杆串接质谱对主流烟气中的丙烯酰胺进行检测。通过本专利技术的在线分析方法，样品不用经任何前处理，操作简单，重复性和回收率好，适用于大批量样品的分析。【专利说明】
本专利技术属于液相色谱-质谱分析技术的领域，具体涉及一种丙烯酰胺巯基尿酸代谢物即N-乙酰-S- (2 —氨基甲酰乙基)-L-巯基丙氨酸(AAMA)、N-乙酰-S- (2-氨基甲酰-2-羟基乙基)-L-巯基丙氨酸(GAMA)的自动在线分析方法。
技术介绍
2001年，周元陵在《生物标志物巯基尿酸的研究进展》中指出由于巯基尿酸是外源性亲电子化合物与GSH结合后代谢的终产物，所以，它能反映这些化合物的原型、中间产物以及它们与GSH结合的机制和在生物体内的代谢状况。，丙烯酰胺巯基尿酸代谢物N-乙酰-S-(2 一氨基甲酰乙基)-L-巯基丙氨酸(AAMA)、N-乙酰-S- (2-氨基甲酰-2-羟基乙基)-L-巯基丙氨酸(GAMA)含量水平反映了人体对丙烯酰胺的吸收情况，是评价丙烯酰胺暴露水平特异而敏感的生物标记物。由于GAMA含量较低，为了实现AAMA、GAMA的同时测定，文献中报道方法常需要对尿样进行复杂的富集净化。如2005年，Melanie Isabell Boettcher, 2007年，ThomasBjellaas均采用固相萃取，浓缩富集样品，然后利用LC-MS-MS对尿液中AAMA、GAMA进行测定，前处理过程较为复杂。采用柱转换在线预处理技术能实现生物样品在线富集净化，免去了其它前处理方法中繁琐的操作，已成功应用于体外DNA加合物、尿液中核苷的在线预处理。
技术实现思路
本专利技术的目的即建立简单、灵敏、准确的丙烯酰胺巯基尿酸代谢物AAMA及GAMA分析方法。本专利技术以Agilent 6490质谱仪(美国Agilent公司)；Agilent 1200高效液相色谱系统(包括2个二元液相泵，美国Agilent公司)；六通阀；富集柱；分析柱构建了自动在线分析尿液中AAMA、GAMA系统。样品经离心后，无需经过任何净化，可直接进系统分析。实现了样品在线富集净化分析的全自动过程。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的: ，是将尿样解冻后加入GAMA-d3、AAMA-d4内标，经混匀、离心后，直接进LC-MS/MS进行AAMA、GAMA定量分析，通过液相色谱柱的选择及流动相组成的优化，以乙腈与0.1%甲酸水溶液为流动相，采用四级杆串接质谱对对丙烯酰胺巯基尿酸代谢物AAMA及GAMA进行检测，具体测定步骤如下: a.标准溶液的配制和标准曲线的制作:分别称取GAMA Img>AAMA IOmg于两个IOml容量瓶中，均以甲醇定容至10ml，得到GAMA及AAMA母液。取GAMA、AAMA母液各Iml于同一个IOOml容量瓶中，以甲醇定容，得到标准品储备液。分别称取GAMA-d3 lmg、AAMA_d410mg，于两个IOml容量瓶中，均以甲醇定容至10ml，得到GAMA_d3及AAMA_d4母液。取GAMA_d3、AAMA-d4母液各200μ?于同一个IOml容量瓶中，以甲醇定容，得到内标溶液。分别取储备液10、20、50、100、200、500、1000μ?于七个10 mL容量瓶中，每个容量瓶中加入内标溶液ΙΟΟμ?，以甲醇分别定容至10mL，得到7个系列标准溶液。利用高效液相色谱串联质谱仪分别测定上述所有浓度的标准溶液中AAMA、GAMA含量，根据待测物及相应内标的峰面积比和二者相应的浓度比绘制标准工作曲线并计算得到其回归方程。b.样品制备:取Iml解冻后的待测测尿样，加入GAMA-d3、AAMA-d4内标溶液ΙΟμ?，经混匀、离心后，利用高效液相色谱串联质谱仪进行检测，根据待测物及相应内标的峰面积比及标准工作曲线的回归方程,计算出样品中GAMA及AAMA含量。c.液相色谱及质谱条件:米用 Waters Symmetry Shield? RP18C30 mm X 2.I mm1.d., 3.5 μ m)为富集柱,Waters Xbridge-C8 (150 mm X4.6 mm 1.d., 5 μ m)为分析柱的柱子配套系统，柱温为室温，各流动相梯度及流速如表1。流动相A、流动相C均为0.1%甲酸水溶液，流动相B、流动相D均为乙腈溶液。表1自动分析系统液相条件【权利要求】1.一种，是对N-乙酰-s_(2 —氨基甲酸乙基)-L-疏基丙氛酸(AAMA)、N_乙酸-S- (2-氛基甲酸_2_羟基乙基)-L-疏基丙氨酸(GAMA)的HPLC-MS/MS的测定分析方法，其特征在于:尿样解冻后加入GAMA-d3、AAMA_d4内标，经混匀、离心后，直接进LC-MS/MS进行AAMA、GAMA定量分析，通过液相色谱柱的选择及流动相组成的优化，以乙腈与0.1%甲酸水溶液为流动相，采用四级杆串接质谱对丙烯酰胺巯基尿酸代谢物AAMA及GAMA进行检测，具体测定步骤如下: a.标准溶液的配制和标准曲线的制作:分别称取GAMA、AAMA标准品，配制含有内标的7个系列标准溶液；利用高效液相色谱串联质谱仪分别测定上述所有浓度的标准溶液中AAMA、GAMA含量，根据待测物及相应内标的峰面积比和二者相应的浓度比绘制标准工作曲线并计算得到其回归方程； b.样品制备:取Iml解冻后的待测测尿样，加入GAMA-d3、AAMA-d4内标溶液ΙΟμ?，经混匀、离心后，利用高效液相色谱串联质谱仪进行检测，根据待测物及相应内标的峰面积比及标准工作曲线的回归方程,计算出样品中GAMA及AAMA含量； c.液相色谱及质谱条件:采用富集柱、分析柱组成的柱子配套系统，柱温为室温，各流动相梯度及流速如表1:流动相Α、流动相C均为0.1%甲酸水溶液，流动相B、流动相D均为乙腈溶液， 表1自动分析系统液相条件 2.根据权利要求1所述的，其特征在于:标准溶液的具体配制方法如下:分别称取GAMA、AAMA—定量于两个IOml容量瓶中，得到GAMA及AAMA母液；取GAMA、AAMA母液各一定量于同一个100ml容量瓶中，以甲醇定容，得到标准品储备液；分别称取GAMA-d3、AAMA-d4 —定量于两个IOml容量瓶中，均以甲醇定容至10ml，得到GAMA-d3及AAMA_d4母液；取GAMA_d3、AAMA_d4母液各一定量于同一个IOml容量瓶中，以甲醇定容，得到内标溶液；分别取标准品储备液10、20、50、100、200、500、1000PL于七个10 mL容量瓶中，每个容量瓶中加入内标溶液ΙΟΟμ?，以甲醇分别定容至10mL，得到7个系列标准溶液。3.根据权利要求1所述的，其特征在于:所述富集柱为 Waters Symmetry Shield? RP18 规本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种尿液中丙烯酰胺巯基尿酸代谢物的自动在线分析方法，是对N?乙酰?S?（2－氨基甲酰乙基）?L?巯基丙氨酸（AAMA）、N?乙酰?S?（2?氨基甲酰?2?羟基乙基）?L?巯基丙氨酸（GAMA）的HPLC?MS/MS的测定分析方法，其特征在于：尿样解冻后加入GAMA?d3、AAMA?d4内标，经混匀、离心后，直接进LC?MS/MS进行AAMA、GAMA定量分析，通过液相色谱柱的选择及流动相组成的优化，以乙腈与0.1%甲酸水溶液为流动相，采用四级杆串接质谱对丙烯酰胺巯基尿酸代谢物AAMA及GAMA进行检测，具体测定步骤如下：a.?标准溶液的配制和标准曲线的制作：分别称取GAMA、AAMA标准品，配制含有内标的7个系列标准溶液；利用高效液相色谱串联质谱仪分别测定上述所有浓度的标准溶液中AAMA、GAMA含量，根据待测物及相应内标的峰面积比和二者相应的浓度比绘制标准工作曲线并计算得到其回归方程；?b.样品制备：取1ml解冻后的待测测尿样，加入GAMA?d3、AAMA?d4内标溶液10μL，经混匀、离心后，利用高效液相色谱串联质谱仪进行检测，根据待测物及相应内标的峰面积比及标准工作曲线的回归方程，计算出样品中GAMA及AAMA含量；c.?液相色谱及质谱条件：采用富集柱、分析柱组成的柱子配套系统，柱温为室温，各流动相梯度及流速如表1：流动相A、流动相C均为0.1%甲酸水溶液，流动相B、流动相D均为乙腈溶液，表1?自动分析系统液相条件液相色谱仪中六通阀转换时间：?上样0.3分钟后，尿样中AAMA、GAMA完全富集在富集柱上，富集过程完成，六通阀第一次转换，开始将目标物冲淋至分析柱；自上样0.75分钟后，目标物完全进入分析柱，六通阀第二次转换，目标物在分析柱上进行分离，而富集柱进入净化柱子，平衡系统过程；测定样品时质谱条件为：离子源：电喷雾电离源（ESI）；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；干燥气温度：290℃，流量：11L/min;?雾化气压力：30?psi；鞘气温度：400℃，流量：12L/min；毛细管电压：3500?V；?AAMA、GAMA及相应内标定量离子对、驻留时间、碰撞能量见表2：表2?自动分析质谱条件?定量离子对驻留时间ms碰撞能vGAMA249/120100?19GAMA?d3252/120100?19AAMA233/104100?18AAMA?d4237/108100?18????。201310430789X100001dest_path_image001.jpg...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王冰，王昇，赵阁，余晶晶，谢复炜，蔡君兰，张晓兵，刘惠民，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，
类型：发明
国别省市：
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