一种鉴别鸭骨骼肌中肌纤维类型的方法技术

本发明专利技术公开了一种鉴别鸭骨骼肌中肌纤维类型的方法，包括如下步骤，（1）制作切片：将鸭的骨骼肌肉利用液氮-异戊烷体系冷却，采用冷冻切片法制作出切片；（2）漂洗切片：将（1）步制作好的切片置于载玻片上，在室温条件下，自然晾干至切片发白，利用Tris洗液漂洗两次，每次漂洗1min；（3）切片的第一次孵育处理；（4）切片的第二次孵育处理；（5）切片的染色处理；（6）经上步染色处理后的切片用照相显微镜观察并拍照，利用ImagePro-plus6.0软件测得的不同光密度值即可判定鸭骨骼肌中肌纤维的类型。本发明专利技术的优点，经过本发明专利技术方法处理的肌纤维颜色深浅明显、清晰、辨识度高，节省试验成本。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，包括如下步骤，（1）制作切片：将鸭的骨骼肌肉利用液氮-异戊烷体系冷却，采用冷冻切片法制作出切片；（2）漂洗切片：将（1）步制作好的切片置于载玻片上，在室温条件下，自然晾干至切片发白，利用Tris洗液漂洗两次，每次漂洗1min；（3）切片的第一次孵育处理；（4）切片的第二次孵育处理；（5）切片的染色处理；（6）经上步染色处理后的切片用照相显微镜观察并拍照，利用ImagePro-plus6.0软件测得的不同光密度值即可判定鸭骨骼肌中肌纤维的类型。本专利技术的优点，经过本专利技术方法处理的肌纤维颜色深浅明显、清晰、辨识度高，节省试验成本。【专利说明】
本专利技术属于利用动物肌纤维活性改良肌肉功能及肌肉品质性状的
，具体是。
技术介绍
肌纤维是构成肌肉的基本单位，肌纤维的形成是极其复杂的，经历了一个由前体干细胞发育为成熟肌纤维的渐进过程，大体上可以被分为四个阶段:第一阶段是来自中胚层的间充质干细胞发生终末分化形成单核成肌细胞；第二阶段是单核的成肌细胞融合形成梭形的多核细胞肌管；第三阶段是肌管进一步分化形成成肌纤维；第四阶段是肌纤维的生长并最终达到成熟。大多数陆栖脊椎动物肌纤维发育的前三个阶段在胚胎期基本上就已经完成，动物出生后肌纤维的数目不再改变，肌肉的生长主要依赖于肌纤维长度增加和直径增大。因此，胚胎期动物肌纤维的发育将影响其出生后肌肉的产量。而肌纤维类型并不是出生前就确定下来的，在动物生长过程中，它受到品种、年龄、营养、内分泌及机体各级调控因子的影响。根据肌纤维的形态、功能和生理生化特性，可将肌纤维分成不同的类型，在禽类较常用的肌纤维分类方式是根据所含的酶系及其活性特点，将肌纤维分为三型:慢肌纤维(红肌纤维、I型、氧化型肌纤维)；快红肌纤维(中间型纤维、IIa型、快速氧化型纤维)；快白肌纤维(白肌纤维、IIb型、快速酵解型纤维)。将肌纤维的类型区分开，可以看出不同类型肌纤维的活性和功能，据报道，胚胎期到新生期也被称为是次级纤维形成期，是肌纤维类型分化非常重要的时期，胚胎期动物肌纤维的发育将影响出生后的肌肉产量，胚胎期肌纤维特性是决定肉质和代谢的重要因素，因此，在胚胎期进行肌纤维类型的准确判定、及对各种类型肌纤维特性的研究对研究骨骼肌功能及肉品质性状的遗传改良将具有重要的意义。目前现有的方法主要是采用对肌纤维Guth-Samaha肌球蛋白染色方法进行骨骼肌肌纤维分型，该方法自上世纪70年代建立以来，已成为骨骼肌功能相关研究的重要手段之一。该染色方法的原理是，三磷酸腺苷酶(ATP酶)与肌肉的能量代谢密切相关，可催化ATP水解生成ADP及无机磷的反应，这一反应放出大量能量，用于运送离子进出细胞，同时供给生物体进行需能生命过程。利用染色剂将骨骼肌纤维染色后，磷酸与钙离子结合，在酶活性处形成无色的磷酸钙，磷酸钙经氯化钴处理形成磷酸钴，再经硫化铵处理形成棕黑色的硫化钴沉淀在酶活性部位。因此通过这种染色方法，可以根据不同肌纤维的ATP酶的酶活性的高低，形成不同量的棕黑色颗粒沉积于肌纤维中。然后，可根据反应的深浅程度区分不同肌纤维类型。现在比较先进的Guth-Samaha肌球蛋白染色方法，是刊登在《解剖学杂志》中的文章“肌球蛋白三磷酸腺苷酶的染色技术”所公开的方法(肌球蛋白三磷酸腺苷酶的染色技术.解剖学杂志，2004，27:104-105，作者高美钦等) 染色方法主要包括以下步骤: (1)将肌纤维切片置于固定液中固定5分钟； (2)碱性预孵液(巴比妥纳贮备液:巴比妥纳206mg，氯化钙lOOmg，双蒸水50ml，4g/LNaOH调pH值至10.4 ± (λ 01)中25°C预孵10分钟； (3)置底物孵育液(巴比妥纳贮备液10ml，ATP-二钠盐15mg，4g/LNaOH调pH值至9.4±0.01)中 37°C孵育 60 分钟； (4)入2%氯化钴溶液中室温反应3分钟； (5)充分水洗，双蒸水洗过一遍； (6)入1%硫化胺溶液反应I分钟； (7)流水冲洗5分钟； (8)脱水、透明、中性树胶封片。上述方法适用于人、鼠等哺乳类动物，但存在所用的试剂配制比较繁复，并每次都要新鲜配制的问题，限制了该方法的推广应用。同时，由于不同物种骨骼肌肌球蛋白ATP酶的PH值稳定性存在差异，利用此染色剂，对鸭骨骼肌中肌纤维不适用，纤维界限不清楚，染色背景深，无法区分出肌纤维的类型，目前尚未有鸭骨骼肌纤维类型鉴别方法的报道，鸭骨骼肌纤维类型的鉴别技术尚未建立。因此，需要开发一种简单方便，能够快速准确鉴别鸭骨骼肌中肌纤维类型的方法。
技术实现思路
为解决利用现有相近领域鉴别不出鸭骨骼肌中肌纤维类型，以及现有鸭骨骼肌肌纤维类型鉴别方法空白的缺陷，本专利技术提供了，实现了利用此方法能够清晰的鉴别出骨骼肌中各种肌纤维类型的目的。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为，本专利技术开发出的，包括如下步骤，(I)制作切片:将鸭的骨骼肌肉利用液氮-异戊烷体系冷却，采用冷冻切片法制作出切片； (2)漂洗切片:将(I)步制作好的切片置于载玻片上，在室温条件下，自然晾干至切片发白，利用Tris洗液漂洗两次，每次漂洗Imin ； (3)切片的第一次孵育处理:经(2)步处理的切片置入碱性预孵育液中，在20?30°C条件下孵育15min，碱性预孵育液的成份包括氯化钙、甘氨酸、甲醛、氢氧化钠；现有方法中将切片漂洗后需要先将切片用甲醛固定，本专利技术的方法中省掉了这个步骤，采用在预孵液中加入甲醛的方法，防止由于固定带来的ATP酶活性的降低，从而改进了染色效果，同时由于巴比妥纳目前很难购买且价格较高，采用在预孵液中用甘氨酸代替巴比妥纳的方法，不仅节省了试验成本，又为后续染色效果的提高提供基础，碱性预孵育液成份作出改变，预孵育的温度、时间这些条件都是经过试验得出孵育效果最好的参数，不断重复整个方法的步骤，用各种温度和时间参数去试验，最终得到的温度和时间是能使肌肉保持原有的活性，从而使经后续步骤后试验结果准确、稳定。(4)切片的第二次孵育处理:经(3)步处理的切片利用Tris洗液漂洗后，在滤纸上将切片上的液体吸干，置入ATP孵育液中，在温度为37°C的培养箱中孵育60min，ATP孵育液的成份包括甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、氯化钙、ATP ;用甘氨酸取代了现有使用的巴比妥纳，不仅使试验成本降低了，经过试验证明，使用甘氨酸孵育处理后，染色效果更佳，染色后的切片肌肉纤维颜色深浅明显，利用显微镜观察也可分辨出肌肉纤维的类型，ATP孵育液成份作出改变，预孵育的温度、时间这些条件都是经过试验得出孵育效果最好的参数，不断重复整个方法的步骤，用各种温度和时间参数去试验，最终得到的温度和时间是能使肌肉保持原有的活性，从而为后续染色步骤打下良好的基础，去除掉一些影响因素，保证染色后的切片各种类型的肌纤维颜色深浅清晰、可辨识。(5)切片的染色处理:①经上步处理的切片用质量浓度为13.3g/L氯化钙溶液洗涤4次，每次I?2min ;②将切片用滤纸吸干后浸溃在质量百分比浓度为2%的氯化钴溶液中3min ;③用纯水冲洗切片4次,每次I?2min 再将切片浸溃在质量百分比浓度为2%的硫化铵溶液中3?4min ;⑤用流水冲洗切片3min后,纯水再清洗一次最后依本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴别鸭骨骼肌中肌纤维类型的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤，（1）制作切片：将鸭的骨骼肌肉利用液氮?异戊烷体系冷却，采用冷冻切片法制作出切片；（2）漂洗切片：将（1）步制作好的切片置于载玻片上，在室温条件下，自然晾干至切片发白，利用Tris洗液漂洗两次，每次漂洗1min；（3）切片的第一次孵育处理：经（2）步处理的切片置入碱性预孵育液中，在20～30℃条件下孵育15min，碱性预孵育液的成份包括氯化钙、甘氨酸、甲醛、氢氧化钠；（4）切片的第二次孵育处理：经（3）步处理的切片利用Tris洗液漂洗后，在滤纸上将切片上的液体吸干，置入ATP孵育液中，在温度为37℃的培养箱中孵育60min，ATP孵育液的成份包括甘氨酸?氢氧化钠缓冲液、氯化钙、ATP；（5）切片的染色处理：①经上步处理的切片用质量浓度为13.3g/L氯化钙溶液洗涤4次，每次1～2min；②将切片用滤纸吸干后浸渍在质量百分浓度为2%的氯化钴溶液中3min；③用纯水冲洗切片4次，每次1～2min；④再将切片浸渍在质量百分浓度为2%的硫化铵溶液中3～4min；⑤用流水冲洗切片3min后，纯水再清洗一次；⑥最后依次用体积百分浓度为50%、70%、96%、100%的乙醇溶液将切片脱水，用二甲苯透明后中性树胶封片；?（6）经上步染色处理后的切片用照相显微镜观察并拍照，利用Image?Pro?plus?6.0软件测得的不同光密度值即可判定鸭骨骼肌中肌纤维的类型。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李慧芳，束婧婷，朱文奇，单艳菊，宋卫涛，徐文娟，胡艳，朱春红，陶志云，宋迟，章双杰，章明，刘宏祥，姬改革，
申请(专利权)人：江苏省家禽科学研究所，江苏腾达源农牧有限公司，
类型：发明
国别省市：