一种基于超声波穿孔效应并结合激光光镊表面增强拉曼光谱技术进行细胞判别的方法，是利用超声波对细胞作用产生穿孔效应使细胞膜通透性瞬间增强将金属纳米粒子快速导入细胞作为SERS增强基底，并利用激光光镊技术捕获活细胞同时进行表面增强拉曼光谱检测，以SERS光谱的手段实现对癌细胞的病理检测、筛选功能。本发明专利技术包括银胶溶液制备；把高浓度银胶注入活细胞并进行表面增强拉曼光谱测量；建立判别细胞为正常细胞或者癌症细胞表面增强拉曼光谱诊断识别模型。本发明专利技术具有简单迅速，可靠性强，灵敏度高的特点，可推广应用于多种癌变细胞的判别。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】一种基于超声波穿孔效应并结合激光光镊表面增强拉曼光谱技术进行细胞判别的方法，是利用超声波对细胞作用产生穿孔效应使细胞膜通透性瞬间增强将金属纳米粒子快速导入细胞作为SERS增强基底，并利用激光光镊技术捕获活细胞同时进行表面增强拉曼光谱检测，以SERS光谱的手段实现对癌细胞的病理检测、筛选功能。本专利技术包括银胶溶液制备；把高浓度银胶注入活细胞并进行表面增强拉曼光谱测量；建立判别细胞为正常细胞或者癌症细胞表面增强拉曼光谱诊断识别模型。本专利技术具有简单迅速，可靠性强，灵敏度高的特点，可推广应用于多种癌变细胞的判别。【专利说明】
本专利技术是涉及一种利用超声波穿孔效应并结合激光光镊表面增强拉曼光谱(SERS)技术分析细胞的方法。
技术介绍
多种生物医学技术已经被应用于定性、定量的去探测、筛选正常或病变细胞。比如现在的放射学、药理学、组织学、细胞学以及分子学技术都可以应用在细胞的分析上。但是，这些技术都是具有破坏性的，同时它们的特异性不够理想，并且很多时候要多种技术联用才能进行有效的分析，而且还可能会受到细胞生物学手段的干扰。我们现在急需一种技术手段能够克服上述几种细胞分析技术局限性，能够在临床诊断上容易实现精确癌细胞分析与筛选。表面增强拉曼光谱(SERS)技术与常规拉曼光谱相比能够使拉曼信号增强因子达到1014，在某些条件甚至能够实现单分子检测。同时，SERS技术还能够在很大程度上抑制生物自体荧光背景的干扰。因此，SERS技术已经被广泛应用于生物医学领域的研究。世界上已经有多个研究小组利用SERS光谱进行细胞研究，但要想检测到细胞SERS光谱信号，就必须要通过某种特殊方法使金属纳米粒子导入细胞内部或使纳米粒子与细胞能够紧密吸附在一起，这样才能检测到细胞的SERS光谱信号。要使纳米粒子进入细胞内部能够进行SERS检测，现在比较常用的办法是把金属纳米粒子与细胞共同培养、孵育，经过长时间的培育(一般要24小时左右)，利用细胞的内吞效应，纳米粒子就能够被“吞”进细胞内部，从而实现细胞SERS光谱检测分析，但这种方法非常耗费时间；第二种方法就是利用生物细胞的自主还原机制，将带有金属离子的溶液与细胞共同孵育，在细胞内部自发“长出”纳米金属颗粒，这种方法同样需要长时间进行细胞培养，而且在细胞内部被还原出来的金属纳米颗粒形状不规则；第三方法是利用电穿孔技术快速将金属纳米粒子导入到细胞内的输送，但这种方法需要特殊的电穿孔设备、操作比较复杂、效率低，而且纳米粒子在细胞中的分布很不均匀。鉴于以上各种方法的不足之处，本专利技术专利提出利用超声波声孔效应将金属纳米粒子快速导入细胞，并将激光光镊拉曼光谱技术与这种超声诱导技术相结合能够检测获得高重现性的细胞SERS光谱，我们还进一步利用细胞SERS光谱进行癌细胞与正常细胞的筛选研究，获得非常理想的判别效果。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用超声波声孔效应结合激光光镊表面增强拉曼光谱技术进行细胞分析的方法。它是利用高能超声波作用瞬间产生声孔效应，使细胞周围的微小气泡发生剧烈收缩、膨胀并最终崩灭，与此同时这些发生剧烈变化的气泡与细胞发生热作用和机械作用在细胞膜上产生穿孔效应，在细胞膜表面产生可逆性孔状结构，使细胞膜通透性瞬间大大增强；同时金属纳米粒子在超声波作用下形成单分散且处于高速运动状态，这样就可通过细胞膜表面短暂瞬间产生的小孔将金属纳米粒子快速导入细胞内部作为SERS增强基底，并利用激光光镊技术捕获细胞同时进行表面增强拉曼光谱检测，最后对获得的细胞SERS光谱数据进行多变量统计分析(PCA-LDA)处理，通过散点图中的诊断方程可以判别细胞为癌症或者正常细胞。我们以鼻咽癌细胞和正常鼻咽细胞为模型对癌症或者正常细胞的进行判别分析。在测量过程中利用激光光镊技术能够维持细胞处于生理活性状态下进行SERS光谱测试。本专利技术所述的整个处理过程时间仅仅需要10分钟，操作简单、快速、可靠性强；能够使金属纳米粒子非常高效地导入细胞中，并且金属纳米粒子分布比较均匀，能够获得重现性非常好的细胞SERS光谱。对正常和癌症细胞的激光光镊SERS光谱判别、分析结论可为医生对病人的诊断提供快速、客观的评价标准。可将此方法拓展、应用于其它多种癌症细胞与正常细胞的判别分析。为实现本专利技术的目的采用的技术方案是: (1)取硝酸银粉末溶于200ml的去离子水中加热至沸腾，再滴入柠檬酸三钠溶液制成含有银纳米粒子的银胶溶液备用； (2)将胰酶消化下来的活性细胞用RPMI1640细胞培养液制成单细胞悬浮液备用； (3)将银胶溶液和单细胞悬浮液混合并利用超声波穿孔效应将银纳米粒子快速导入细胞； (4)在维持生理环境下对单细胞进行激光光镊表面增强拉曼光谱检测； (5)建立细胞表面增强拉曼光谱数据库，利用多变量统计分析获得不同种类细胞的表面增强拉曼光谱对应的散点图； (6)利用建立细胞表面增强拉曼光谱数据库，对未诊断细胞进行判别。所述的银胶溶液的制备过程是:取36mg硝酸银粉末溶于200ml的去离子水中，快速搅拌并加热至沸腾，再滴入5ml浓度为1%柠檬酸三钠溶液，继续搅拌加热I小时，制备获得含有银纳米粒子的银胶溶液，并放在室温下避光封存备用； 所述的单细胞悬浮液的制备过程是:将胰酶消化下来的活性细胞用RPMI1640细胞培养液制成单细胞悬浮液，然后通过血球计数板计算细胞的数目，控制细胞密度为IO5?IO6个/ml。所述的利用超声波穿孔效应将银纳米粒子快速导入细胞内部过程是:取预制备的好的银胶溶液I ml进行离心，弃上清液后加入0.5ml的细胞培养液，与预制备好的活性单细胞悬浮液按1:1的比例放入离心管中，利用200ul的移液枪通过多次抽吸的方式使它们混合均匀，制成活性单细胞银胶混合液；将离心管放入超声池中，通过调节超声波的功率、频率，超声池的温度、超声时间参数，将离心管中的活性单细胞银胶混合液超声作用；将超声作用过的活性单细胞银胶混合液与PBS缓冲液混合并进行低速离心、清洗三次，将没有进入细胞内部的银纳米颗粒清洗干净，并将清洗过的细胞重新悬浮在RPMI1640细胞培养液中备用。所述的超声波的功率为:200W?400W。所述的超声波的频率为:25HZ、40HZ或59HZ ； 所述的超声池的温度为:室温?60°C ； 所述的超声时间为:lmin?30min。所述的在维持生理环境下对单细胞进行激光光镊表面增强拉曼光谱检测过程是采用美国Thorlabs公司生产的附带有拉曼光谱模块的激光光镊系统(型号:0TKB)，利用该激光光镊系统捕获RPMI1640细胞培养液中活性单细胞，同时利用波长为785nm的半导体激光器作为激发光进行细胞SERS光谱检测。为获得高重现性SERS光谱，在保证能够捕获住细胞的条件下尽量降低激发光功率进行细胞SERS光谱测试，可获得高重现性细胞SERS光谱。所述的建立细胞表面增强拉曼光谱数据库模型，其过程是:对细胞性质进行判别必须由一个诊断模型来实现，而这一模型是通过定标过程来建立的。为保证数据具有统计意义，需要采集足够多确诊病例的细胞SERS光谱，建立定标光谱数据库。在此基础上，使用主元素分析方法和线性判别分析算法，建立由细胞SERS光谱参数构成的诊断方程。我们首先需对细胞SERS本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种超声波穿孔?激光光镊细胞表面增强拉曼光谱分析方法，其特征在于该方法由以下步骤组成：?（1）取硝酸银粉末溶于200ml的去离子水中加热至沸腾，再滴入柠檬酸三钠溶液制成含有银纳米粒子的银胶溶液备用；（2）将胰酶消化下来的活性细胞用RPMI1640细胞培养液制成单细胞悬浮液备用；（3）将银胶溶液和单细胞悬浮液混合并利用超声波穿孔效应将银纳米粒子快速导入细胞；（4）在维持生理环境下对单细胞进行激光光镊表面增强拉曼光谱检测；（5)?建立细胞表面增强拉曼光谱数据库，利用多变量统计分析获得不同种类细胞的表面增强拉曼光谱对应的散点图；（6）利用已建立细胞表面增强拉曼光谱数据库，对未诊断细胞进行判别。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：冯尚源，黄少华，林居强，陈冠楠，黄祖芳，李永增，陈荣，
申请(专利权)人：福建师范大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。