本发明专利技术是一种表达嗜热毛壳菌Chaetomium?thermophilum热稳定热稳定9家族糖苷水解酶基因CtAA9c的毕赤酵母工程菌Pichia?pastoris?GS-CT-9C。通过RT-PCR方法从嗜热毛壳菌Chaetomium?thermophilum获得糖苷水解酶基因CtAA9c，将其克隆并插入到毕赤酵母整合表达载体pPIC9K中，然后将得到的糖苷水解酶基因CtAA9c表达载体pPIC9K/CtAA9c导入到毕赤酵母GS115中，再从中筛选出一种表达糖苷水解酶基因CtAA9c的酵母工程菌GS-CT-9C。该工程菌表达的糖苷水解酶CtAA9C对内切纤维素酶的活性具有明显的促进作用，混合酶比原始内切酶N24的降解纤维素的活性提高1.4倍。在Mn2+条件下，CtAA9C和CtAA9C+N24的纤维素酶活性可分别提高15倍和3.5倍。CtAA9C具有良好的热稳定性和提高纤维素酶活力的能力，可广泛用于纤维废料及其它工业领域，具有重大经济价值和社会价值。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术是一种表达嗜热毛壳菌Chaetomium?thermophilum热稳定热稳定9家族糖苷水解酶基因CtAA9c的毕赤酵母工程菌Pichia?pastoris?GS-CT-9C。通过RT-PCR方法从嗜热毛壳菌Chaetomium?thermophilum获得糖苷水解酶基因CtAA9c，将其克隆并插入到毕赤酵母整合表达载体pPIC9K中，然后将得到的糖苷水解酶基因CtAA9c表达载体pPIC9K/CtAA9c导入到毕赤酵母GS115中，再从中筛选出一种表达糖苷水解酶基因CtAA9c的酵母工程菌GS-CT-9C。该工程菌表达的糖苷水解酶CtAA9C对内切纤维素酶的活性具有明显的促进作用，混合酶比原始内切酶N24的降解纤维素的活性提高1.4倍。在Mn2+条件下，CtAA9C和CtAA9C+N24的纤维素酶活性可分别提高15倍和3.5倍。CtAA9C具有良好的热稳定性和提高纤维素酶活力的能力，可广泛用于纤维废料及其它工业领域，具有重大经济价值和社会价值。【专利说明】表达9家族糖苷水解酶基因CtAA9c的毕赤酵母工程菌株(-)
本专利技术涉及生物工程，具体地说是一种表达具体地说是以嗜热毛壳菌Chaetomiumthermophilum9家族糖苷水解酶基因CtAA9c的毕赤酵母工程菌株Pichia pastorisGS-CT-9C。(二)
技术介绍
糖苷水解酶(英语:Glycoside hydrolases,又称糖苷酶)是一种专门水解配糖键(glycosidic bond)，并产生两个较小的糖分子的酵素，也是自然界中的常见酵素之一。这类蛋白质在人类的产业上也有所应用，例如用来将纤维素与半纤维素等生物质能降解成可用的小分子。糖苷水解酶具有多个家族。嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum是一种广泛分布于土壤中的嗜热真菌。该菌在微晶纤维素为唯一碳源的培养基中50°C条件下可以产生热稳定的纤维素酶和9家族糖苷水解酶。嗜热毛壳菌产生的9家族糖苷水解酶CtAA9C具有微弱的纤维素酶活性，但对该菌株产生的内切纤维素酶N24的酶活性具有明显的促进作用，可使其活性提高1.4倍。在不同金属离子如Mn2+的作用下，CtAA9C和CtAA9C+N24的活性可分别提高15倍和3.5倍。(三)
技术实现思路
本专利技术从嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum获得内切β-1, 4-葡聚糖酶基因的cDNA序列全长，命名为CtAA9c，CtAA9c基因DNA全长1020bp，包括信号肽序列，起始密码子和终止密码子，无内含子，编码313个氨基酸，具有信号肽序列(l-26aaMPPSTSSLLSILLTLSSTLIH)PVFA)。将CtAA9c编码的氨基酸序列在国际基因库中进行检索，发现属于糖苷水解酶第9家族。构建重组表达质粒载体pPIC9K/CtAA9c，利用电转仪进行电击转化Pichiapastoris GSl 15，在MD和丽培养基上筛选，经PCR鉴定筛选阳性转化子，G418筛选多拷贝转化子，然后进行甲醇诱导表达，获得毕赤酵母工程菌株GS-CT-9C。该工程菌株接种于含BMGY培养基中，在28°C 200rpm/min摇床培养6d后，糖苷水解酶的表达量为3.24mg/ml，分子量为65KDa，酶活力为0.0483~1111，(^449(:在651:下是稳定的，处理601^11后仍有95%以上的酶活性；70°C处理30min后仍保持74.4%的活性；80°C处理30min后保持24.8%的活性；90°C处理30min活性几乎完全丧失。9家族糖苷水解酶CtAA9C对嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum内切纤维素酶N24的酶活性具有明显的促进作用，混合酶比原始酶N24的降解纤维素的能力提高1.4倍。不同金属离子对CtAA9C和CtAA9C+N24混合酶活性具有促进或抑制作用，其中在Mn2+条件下，CtAA9C和CtAA9C+N24的纤维素酶活性可分别提高35倍和3.5倍。(四)【专利附图】【附图说明】:图1 9家族糖苷水解酶CtAA9C的SDS-PAGE分析泳道1:低分子量蛋白标准泳道2:纯化的9家族糖苷水解酶CtAA9C图2 A: 9家族糖苷水解酶CtAA9C的最适温度B: 9家族糖苷水解酶CtAA9C的热稳定性测定图3 9家族糖苷水解酶CtAA9C对内切纤维素酶N24活性的促进作用图4金属离子Mn2+对CtAA9C纤维素酶及混合酶活性的影响(五)【具体实施方式】实施例1:嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum的分离鉴定(I)标本采集:从堆肥中采集。(2)分离培养:将采集标本取0.5克放置在PDA平板上50°C培养3天后，进行分离纯化。操作步骤参考Cooney and Emerson (1964)文献。(3)鉴定:参考 Coo ney and Emerson (1964)和 LaTouche (1950)文献。实施例2:糖苷水解酶基因CtAA9c的克隆(I)嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum总RNA的提取:参照Trizol试剂盒说明。(2)cDNA 第一条链的合成:按照 Takara 公司的 TaKaRa RNA PCR kit (AMV) Ver3.0试剂盒说明书进行:取I~2 μ g总RNA，加RNase Free ddH20至9.5 μ L，将RNA样品在75°C变性5min，立即在冰浴中冷却5min，然后稍微离心一下，在冰浴中依次加入以下各种成分:10mmol/L dNTP Mixture 2 μ L, IOXRT Buffer (Mg2+) 2 μ L，25mmol/L MgCl24y L, Oligod (T) -Adaptor Primer I μ L, RNase Inhibiter 0.5 μ L, AMV Reverse Transcriptase IuL(Final Volume 20 μ L),将反应液混合后，室温下放IOmin,然后42°C温育60min,再煮沸5min以灭活反转录酶。加入180 μ L DEPC处理的ddH20，稀释至200 μ L，混匀，稍微离心，保存于-20°C，备用。(3) PCR 反应(25yL):cDNA 2 μ L, IOXBuffer 2.5 μ L, 10mmol/L dNTP2μ L, 25mmol/LMgC12 2 μ L,上、下游引物各 2 μ L，Taq DNA 聚合酶 0.5yL(5U/μ L), ddH2012y L0 反应条件为 94°C 5min 预变性；94°C 40s，54°C 40s, 72 °C lmin,共 32个循环，72°C延伸10min，4°C保存。上游引物:5’ -ATGCCTCCTTCAACGAGTTCAC-3 ’下游引物:5’ -TTAACCCCTAAGATGATAC-3 ’(4)基因克隆:取0.5μ I PCR产物与pMD18-T载体进行连接，操作步骤按照TAKARA公司产品说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5ci菌株，在表面涂有氨卞青霉素(100 μ g/mL)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种表达嗜热毛壳菌Chaetomium?thermophilum9家族糖苷水解酶基因CtAA9c的酵母工程菌株，其特征在于该菌为一种毕赤酵母，通过RT?PCR方法从嗜热毛壳菌Chaetomium?thermophilum获得热稳定9家族糖苷水解酶基因CtAA9c,将该基因克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K,获得表达重组质粒pPIC9K/CtAA9c,转化毕赤酵母GS115,从中筛选出表达热稳定糖苷水解酶基因CtAA9c的毕赤酵母工程菌株GS?CT?9C，该糖苷水解酶CtAA9C对内切纤维素酶的活性具有明显的促进作用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李多川，韩超，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：
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