一种酿酒酵母工程菌生产β-香树脂醇的方法技术

本发明专利技术提供了一种酿酒酵母工程菌生产β-香树脂醇的方法，属于生物化工领域。本发明专利技术从白色念珠菌中克隆2,3-氧化鲨烯单氧酶基因，化学合成经密码子优化的光果甘草β-香树脂醇合酶基因，利用酿酒酵母组成型启动子构建基因表达盒，与双酶切后的质粒共同转化酿酒酵母，通过酿酒酵母的同源重组功能实现基因表达盒与质粒的组装，从而强化了2,3-氧化鲨烯单氧酶并导入了β-香树脂醇合酶。本发明专利技术的酿酒酵母工程菌代谢葡萄糖直接合成β-香树脂醇，β-香树脂醇的合成与酿酒酵母生长耦合，实现了植物次生代谢产物β-香树脂醇的酿酒酵母人工合成，该方法不需要效应剂诱导、工艺简单，可用于发酵生产β-香树脂醇。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供了，属于生物化工领域。本专利技术从白色念珠菌中克隆2,3-氧化鲨烯单氧酶基因，化学合成经密码子优化的光果甘草β-香树脂醇合酶基因，利用酿酒酵母组成型启动子构建基因表达盒，与双酶切后的质粒共同转化酿酒酵母，通过酿酒酵母的同源重组功能实现基因表达盒与质粒的组装，从而强化了2,3-氧化鲨烯单氧酶并导入了β-香树脂醇合酶。本专利技术的酿酒酵母工程菌代谢葡萄糖直接合成β-香树脂醇，β-香树脂醇的合成与酿酒酵母生长耦合，实现了植物次生代谢产物β-香树脂醇的酿酒酵母人工合成，该方法不需要效应剂诱导、工艺简单，可用于发酵生产β-香树脂醇。【专利说明】
本专利技术涉及一种酿酒酵母工程菌的构建及发酵生产β-香树脂醇的方法，属于生物化工领域。
技术介绍
萜类是一类具有特殊价值的植物次生代谢产物，在抵御感染、紫外辐射、干旱等生物和非生物胁迫方面具有重要功能，许多萜类物质显示出抵御人类疾病的药物活性。甘草酸是中国传统药用植物甘草的最重要萜类化合物，具有抗感染、抗炎、抗溃疡、抗病毒和防治肿瘤等多方面的作用。β -香树脂醇是甘草酸生物合成的重要前体物，不仅具有与甘草酸相似的生物功能，还在抗高血压和降血脂等方面具有特殊作用。但由于β_香树脂醇在甘草中的积累量很少，直接提取工艺复杂、能耗高、且生产周期长，而复杂的分子结构使其化学合成也难以实现。利用微生物发酵方法生产β_香树脂醇生长周期短、过程可控，能够缓解对甘草资源的依赖，具有可观的经济效益和绿色环保的社会效益。β -香树脂醇经萜类共同合成途径的中间产物鲨烯，通过2，3-氧化鲨烯单氧酶和β -香树脂醇合酶催化形成。由于2，3-氧化鲨烯单氧酶在微生物细胞内的比活力很低，且其催化产物2，3-氧化鲨烯具有多个分支代谢，被认为是植物三萜生物合成途径中的关键限速酶之一。另外，在微生物中还未发现β_香树脂醇合酶，因此，异源表达β_香树脂醇合酶是实现微生物合成香树脂醇的必要条件。在微生物体系中，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)由于自身次生代谢途径有限，因而对外源途径的竞争或干扰较少，且酿酒酵母的代谢途径与基因组信息清楚，认为是合成植物次生代谢产物的优秀潜在宿主。通过强化2，3-氧化鲨烯单氧酶的表达和引入β -香树脂醇合酶实现酿酒酵母生产植物天然产物β -香树脂醇，将为植物天然产物的微生物高效合成提供技术支持。
技术实现思路
本专利技术的目的是为解决β -香树脂醇在甘草中积累量低和化学法难以合成的局限，提供一种利用酿酒酵母工程菌生产β -香树脂醇的方法。为达到上述目的，本专利技术的技术方案提供一种酿酒酵母工程菌的构建，从白色念珠菌CGMCC2.2086 (Candida albicans)中克隆2，3-氧化鲨烯单氧酶SQE基因片段，化学合成光果甘草(Glycyrrhiza glabra)中的β _香树脂醇合酶bAS基因片段,从酿酒酵母INVScl中分别克隆组成型启动子TYSlp、FBAlp和终止子TYSlt、FBAlt，然后通过重叠延伸PCR构建2，3-氧化鲨烯单氧酶基因表达盒TYSlp-SQE-TYSlt和β -香树脂醇合酶基因表达盒FBAlp-bAS-FBAlt，与Sal I和BamH I双酶切后的pRS41H质粒共同转入酿酒酵母INVScl中，通过酿酒酵母自身的同源重组实现两个基因表达盒和质粒的连接，以质粒形式存在。本专利技术的酿酒酵母工程菌，为INVScl/pRS41H-(TYSlp-SQE-TYSlt) - (FBAlp-bAS-FBAlt) ， 在其中强化表达了 2，3-氧化鲨烯单氧酶和导入了 β_香树脂醇合酶。本专利技术的酿酒酵母工程菌能够发酵生产β -香树脂醇，实现了 β -香树脂醇的酿酒酵母合成。本专利技术的酿酒酵母工程菌，具有以下优点:1、本专利技术构建的酿酒酵母工程菌，通过酿酒酵母自身的同源重组功能实现基因表达盒和质粒的连接，与传统的限制性酶切、连接组装方法相比，不需要酶切和连接反应，基因操作容易，基因组装过程高效。2,2, 3-氧化鲨烯单氧酶和β -香树脂醇合酶分别受组成型启动子TYSlp和FBAlp控制，β -香树脂醇的合成与酿酒酵母生长耦合，不需要效应剂的诱导，简化了发酵工艺，降低了成本。3、本专利技术的酿酒酵母工程菌代谢葡萄糖直接合成β-香树脂醇，实现了植物次生代谢产物β -香树脂醇的酿酒酵母人工合成,最高生产浓度达25.5mg/L。【专利附图】【附图说明】图1是本专利技术实验例中酿酒酵母工程菌发酵生产β -香树脂醇的组分分析总离子色谱图； 图2是本专利技术实验例中酿酒酵母工程菌发酵生产的β-香树脂醇的质谱图。 【具体实施方式】下面结合实施例，对本专利技术的【具体实施方式】进一步详细描述。以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1:酿酒酵母基因工程菌的构建1、从白色念珠菌CGMCC2.2086中克隆出2，3_氧化鲨烯单氧酶SQE基因片段，与Genbank公布的白色念珠菌2，3-氧化鲨烯单氧酶基因序列(Genbank注册序列号为ΑΒ037203)作BLAST比对，同源性分析显示，克隆的SQE基因片段与Genbank基因库公布的白色念珠菌2，3-氧化鲨烯单氧酶基因的同源性为100%。引物序列为:引物1: 5，>GATTAGCATCCATAACCGCATACTCTAATTGACGATAACATGAGTTCAGTTAAGTATGA〈3’ (如SEQ ID N0.1所示)，下划线序列为与启动子TYSlp重叠序列。引物2:5’ >GCCAAGTAGGCAATTATTTAGTACTGTCAGTATTGTTATCTATCTTACAATCTCGTTCC〈3’ (如SEQ ID N0.2所示)，下划线序列为与终止子TYSlt重叠序列。2、从Genbank基因库中查询获得光果甘草β -香树脂醇合酶bAS基因片段，利用酿酒酵母密码子偏好性进行密码子优化，化学合成后扩增获得bAS基因片段(如SEQ IDN0.3所示)。引物序列为:引物 3:5，>TTGTCATATATAACCATAACCAAGTAATACATATTCAAAATGTGGAGATTGAAGATCGC〈3’ (如SEQ ID N0.4所示)，下划线序列为与启动子FBAlp重叠序列。引物4:5 ’ >ATACTCATTAAAAAACTATATCAATTAATTTGAATTAACTTAAGTCAAACAAACTGGAG〈3’ (如SEQ ID N0.5所示)，下划线序列为与终止子FBAlt重叠序列。3、从酿酒酵母INVScl中克隆组成型启动子和终止子基因片段从酿酒酵母INVScl中克隆组成型启动子TYSlp基因片段引物序列为:引物5:5， >CCAATTGCAAAGGGAAAAGCTGAATGGGCAGTTCGAATACCTTGCGCTTACTCGAATAG〈3’ (如SEQ ID N0.6所示)，下划线序列为与质粒pRS41H重叠序列。引物6:5 ’ >TGCACCAATAATAATAGCATCATACTTAACTGAACTCATGTTATCGTCAATTAGAGTAT〈3’(如SEQ ID N0.7所示)，下划线序列为与SQE上游基因重叠序列。从酿酒酵母IN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酿酒酵母工程菌的构建，其特征在于，从白色念珠菌CGMCC2.2086中克隆2,3?氧化鲨烯单氧酶SQE基因，密码子优化光果甘草中的β?香树脂醇合酶bAS基因并化学合成，从酿酒酵母INVSc1中克隆组成型启动子TYS1p、FBA1p和终止子TYS1t、FBA1t，然后构建2,3?氧化鲨烯单氧酶基因表达盒TYS1p?SQE?TYS1t和β?香树脂醇合酶基因表达盒FBA1p?bAS?FBA1t，与双酶切后的pRS41H质粒共同转入酿酒酵母INVSc1中，利用酿酒酵母的同源重组功能实现两个基因表达盒和质粒的组装连接。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李春，张根林，周晓宏，刘静竹，
申请(专利权)人：北京理工大学，
类型：发明
国别省市：