一种粘红酵母高产亚油酸基因工程菌的构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种粘红酵母高产亚油酸基因工程菌的构建方法和应用，其基因工程菌的构建方法主要将35S强启动子和油桐油酸脱氢酶基因vfFAD2构建表达载体导入粘红酵母，使vfFAD2基因在粘红酵母体内获得高效表达。本发明专利技术提高粘红酵母油脂中亚油酸的含量。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种粘红酵母高产亚油酸基因工程菌的构建方法和应用，其基因工程菌的构建方法主要将35S强启动子和油桐油酸脱氢酶基因vfFAD2构建表达载体导入粘红酵母，使vfFAD2基因在粘红酵母体内获得高效表达。本专利技术提高粘红酵母油脂中亚油酸的含量。【专利说明】一种粘红酵母高产亚油酸基因工程菌的构建方法和应用
本专利技术属于生物工程领域。具体的说，本专利技术涉及一种粘红酵母高产亚油酸基因工程菌的构建方法和应用。
技术介绍
粘红酵母(Rhodotorulaglutinis (Fres.) Harrison)是一种重要的工业菌株，可以生产微生物油脂和其他活性物质，包括类胡萝卜素、L-苯丙氨酸、过氧化物歧化酶，近年来日益受到营养学家和药理学家的重视。目前对于产油粘红酵母基因工程改良的报道不多，特别是以提高亚油酸含量为目的的基因工程改良还未有报道，而亚油酸是人体的必需氨基酸，因此提高粘红酵母油脂中亚油酸的含量有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种粘红酵母野生菌株的构建方法，以提高粘红酵母油脂中亚油酸的含量。本专利技术的技术方案还在于采用了一种粘红酵母生产高亚油酸的基因工程菌的构建方法，利用35S强启动子和油桐vfFAD2基因构建重组表达载体导入粘红酵母，使vfFAD2在粘红酵母种获得高校表达，其基因工程菌构建的具体步骤如下: (1)采用同源序列克隆方法，以油桐基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增得到的产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶回收试剂盒回收纯化，进行TA克隆，并测序，获得目的基因 vfFAD2 ；` (2)目的基因vfFAD2与表达载体pBI121重组，获得重组载体pBI121_vfFAD2，酶切、测序验证重组载体； (3)利用农杆菌介导法，重组载体pBI121-vfFAD2转化粘红酵母，将微孔滤膜转移到含60 μ g*mL-l链霉素，200 μ g*mL_l头孢霉素和100 μ g*mL_l卡那霉素的SM I筛选培养基中，培养3-5 d后，将初筛得到的转化子与野生型粘红酵母同时在含300 yg*mL-l头孢霉素，150 μ g*mL-l卡那霉素的SM II平板上划线，培养3-5 d后，能正常生长的初步认定为阳性转化子； (4)提取基因组DNA、PCR验证获得阳性转化子； (5)气相色谱法检测，转基因粘红酵母转化子中亚油酸含量和粘红酵母野生型相比，亚油酸相对含量则分别从6.65%提高到13.49%，提高了 102.86%。作为优选，所述步骤(2)中扩增引物为:FAD2-Y:5’ -TGTCCTCCGTTCATTCTCAT-3’ ；FAD2-R:5， -GCAAGACGGTAGAGACCAAA-3， PCR反应程序为:94 °C预变性5 min ；94 °C变性30 S，58 °C退火40 S，72 °C延伸50S，35个循环；72 °C延伸10 min ;PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。进一步地，本专利技术的技术方案还采用了一种粘红酵母转化子的筛选方法，所述步骤(4)首先用60 μ g*mL-l链霉素，200 μ g*mL_l头孢霉素和100 μ g*mL_l卡那霉素的SM I筛选培养基培养3-5 d后，再将初筛得到的转化子与野生型粘红酵母同时在含300μ g*mL-l头孢霉素，150 μ g*mL-l卡那霉素的SM II平板上划线筛选，最后提取基因组DNA，进行PCR验证。本专利技术的技术方案还采用了一种粘红酵母的培养方法，其方法具体步骤如下: 将粘红酵母保藏斜面转接到PDA培养基上，28°C培养48h之后，挑2环接入装有50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，28°C振荡培养24h，然后按1:10的接种量接入装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，于28°C振荡发酵72 h，发酵结束经离心收集菌体；种子培养基:15 g.L—1 葡萄糖，I g.L—1 酵母粉，2 g·L-1 (NH4)2SO4, 7 g.L-1 KH2PO4,2 g-L^1Na2HPO4,1.5 g·L-1 MgSO4,PH 5.5;发酵培养基:50 g·L-1 葡萄糖，1 g.·L-1 酵母粉，2.5 g·L-1 (NH4)2SO4,7 g·L-1 KH2PO4, 2 ·L-1 Na2HPO4, 2 g*L-1 MgSO4,0.1 g.L-1CaCl2，0.07 g.L-1FeCl3，PH 5.5。本专利技术的目的还在于提供了一种粘红酵母高产亚油酸基因工程菌(Rhodotorulaglutinis)在生产微生物油脂方面的应用。本专利技术的目的还在于提供了一种粘红酵母高产亚油酸基因工程菌(Rhodotorulaglutinis)在生产功能性油脂方面的应用。本专利技术的目的还在于提供了一种粘红酵母高产亚油酸基因工程菌(Rhodotorulaglutinis)在食品方面的应用。说明书附图 图1.vfFAD2基因的获得及pBI121-vfFAD2酶切、PCR验证；图 1-a.vfFAD2 的 RT-PCR 扩增图1:DNA Marker ；2, 3:vfFAD2 ； 图 1-b.质粒pBI121 的酶切电泳图1:DNA Marker ；2:pBI121 未酶切；3:pBI121 的XbaI/Sac I双酶切；图 1-c.重组质粒 pBI121-vfFAD2 的 PCR 验证，I:DNA Marker ；2, 3:vfFAD2 ； 图2.部分vfFAD2转化子的抗生素筛选及PCR验证；图 2a:SM I 筛选；图 2b:SM II 筛选；图 2c:FAD2_F/R ；图 2d:FAD2-RTF/RTR ；M:DNAmarker 2000 ;1_7:FAD2酵母转化子；8:野生型酵母； 图3.转基因酵母中FAD2基因的表达分析； 图4.转FAD2酵母的脂肪酸组成分析。【具体实施方式】实施例1、油桐FAD2基因对酵母的遗传转化 (I)基因的获得 根据NCBI上已提交的油桐vfFAD2序列(Genbank登录号:AF525534)，利用分子生物学分析软件01igo6.0设计引物:VF2a:5’ TATCTTCAGGTTGGGCAACGA 3’ ；VF2b:5’ CGATTGAACGGCCTACATTAT 3’。PCR扩增vfFAD2基因反应体系: IOXEx buffer (Mg2+ free)2.5 μ LdNTP Mix2.0 μ L 25mM MgCl21.5 μ L VF2al.0yL VF2bl.0yL Templet (油桐种仁总 cDNA) 1.0 μ L ddH2015.9 μ L Ex Taq polymerase0.1 μ L Total25 μ L PCR反应程序:94°C预变性3 min，94°C变性45 s，60°C退火45 s，72°C延伸I min，共35个循环，最后72°C延伸10 min。1%琼脂糖电泳结果如图l_a。目的片段回收及与pMD18_T simple vector连接: 将PCR扩增得到的vfFAD2目的片段进行凝胶回收，回收产物与pMD18-T simplevector 连接: PCR回收产物4 yL pMD1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种粘红酵母高产亚油酸基因工程菌的构建方法，其特征在于，将35S强启动子和油桐油酸脱氢酶基因vfFAD2构建表达载体导入粘红酵母，使vfFAD2基因在粘红酵母体内获得高效表达，其基因工程菌构建的具体步骤如下：（1）粘红酵母进行活化和扩培；（2）采用同源序列克隆法，以油桐基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增得到的产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶回收试剂盒回收纯化，进行TA克隆并测序，获得目的基因vfFAD2；（3）目的基因vfFAD2与表达载体pBI121重组，获得重组载体pBI121?vfFAD2，酶切、测序验证重组载体；（4）利用农杆菌介导法，重组载体pBI121?vfFAD2转化粘红酵母，将微孔滤膜转移到含60?μg?mL?1链霉素，200?μg?mL?1头孢霉素和100?μg?mL?1卡那霉素的SMⅠ筛选培养基中，培养3?5?d后，将初筛得到的转化子与野生型粘红酵母同时在含300?μg?mL?1头孢霉素，150?μg?mL?1卡那霉素的SMⅡ平板上划线，培养3?5?d后，能正常生长的初步认定为阳性转化子，提取基因组DNA，PCR验证获得阳性转化子；（5）气相色谱法检测，转基因粘红酵母转化子中亚油酸含量和粘红酵母野生型相比，亚油酸相对含量则分别从6.65%提高到13.49%，提高了102.86%。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：汪阳东，陈益存，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院亚热带林业研究所，
类型：发明
国别省市：