提供了Wnt组合物和它们的使用方法。本发明专利技术的组合物包含具有期望的生物活性的wnt多肽片段，此类片段在本文中被称为“小型wnt”。这些组合物和方法在下述方面特别有用：确定与Wnt受体的结合；抑制表达Wnt受体的细胞内的Wnt信号转导；将功能部分递送至表达Wnt受体的细胞；和用作制备Wnt-特异性抗体的免疫原。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】WNT组合物及其使用方法专利技术背景Wnt蛋白构成了高度保守的分泌信号转导分子家族，其调控胚胎发生期间的细胞与细胞相互作用。fct基因和Wnt信号转导还与癌症相关。Wnt糖蛋白被认为在多种原初细胞类型中作为有活性的旁分泌或自分泌信号起作用。Wnt生长因子家族包括小鼠和人中鉴定的多于19种基因。Wnt-I原癌基因（int_l)最初从乳腺肿瘤中鉴定到，该乳腺瘤由小鼠乳瘤病毒（MMTV)诱发，由于病毒DNA序列的插入引起（Nusse and Varmus (1982) Cell31:99-109)。Wnt蛋白的表达存在差异,但经常与发育过程相关，例如在胚胎和胎儿组织中。fct可能在局部细胞信号转导中起作用。生化研究表明，可以发现许多分泌fct蛋白与细胞表面或细胞外基质相关，而非在媒介中自由扩散。对Wnt活动机制的深入了解来自多个系统：果蝇（Drosophila)和秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)遗传学；非洲爪蟾（Xenopus)胚胎的细胞培养和异位基因表达生物化学。已经突变了小鼠的许多fct基因，导致非常特定的发育缺陷。根据当前所了解，Wnt蛋白在细胞表面上结合到卷曲蛋白（Frizzled)家族受体、ROR家族受体和LRP5受体、LRP6受体和FRLl受体上。在典型Wnt/β连环蛋白信号转导通路中，Wnt结合到卷曲蛋白受体上导致β连环蛋白的细胞核定位，其接着与TCF络合以激活Wnt靶基因的转录。Wnt基因的突变研究表明了 Wnt在生长调控和组织模式形成中的作用。在果蝇中，无翅基因（wg)编码Wnt基因，且wg突变改变了胚胎外胚层、神经发生和成虫盘增生的模式。在秀丽隐杆线虫中，lin-44编码Wnt，其为不对称细胞分化所必需。小鼠内的敲除突变显示fct为脑发育所必需，以及肾脏、尾芽和肢芽的胚胎原基增生所必需。乳腺内Wnt的过度表达可能导致乳腺增生症 和过早的齿槽发育。因此，fct信号转导涉及众多动物发育事件，包括干细胞增殖和神经嵴的特化。因此fct蛋白为用于扩展特定的细胞类型及治疗体内病症的潜在重要药剂。数据表明在天然形式下，具有生物活性的Wnt需要在蛋白的保守半胱氨酸上进行棕榈酰化，参见，尤其是，Willert et al. (2003)Nature423:448-452 和 Nusse (2005)cell Research 15:28-32。此类脂质基团降低了 Wnt蛋白的水溶性。因此，迄今为止，用于分离生物有效浓度的有活性的天然和重组fct的方法，需要使用洗涤剂或脂质体（参见Willert et al.,同前，Zhao et al. (2009) Methods Enzymol. 465:331-347 和 Morrell etal. (2008) PLoS One 3(8) :e2930)o由于注射此类化学物到动物体内的问题，为了溶解Wnt而对此类化学试剂的需要限制了其药学应用。因此研制具有药学活性的水溶性wnt组合物引起人们很大的兴趣。出版物可溶性无翅基因蛋白的生物活性描述在van Leeuwen et al. (1994)Nature24:368(6469) :342-4中。采用可溶的、具有生物活性的脊椎动物Wnt蛋白的Wnt-卷曲蛋白相互作用的生物化学特征由Hsieh et al. (1999)Proc Natl Acad Sci USA96(7) :3546-51 描述。Bradley et al. (1995)Mol Cell Biol 15(8) :4616-22 描述了具有致有丝分裂活性的wnt蛋白的可溶性形式。Hoppler et al. (1996)Genes andDev. 10:2805-2817描述了显性失活的Wnt多肽，其为截短的Wnt (截短的Xwnt_8和截短的小鼠 Wnt-I)。Couso 和 Martinez-Arias (1994) Cell 79(2) :259-72 描述了 Dwnt-I 的突变等位基因，其编码具有大量羧基末端缺失的具有反效等位基因效应的分泌蛋白。其它显性失活的fct多肽和其使用方法描述在W02010/078458中。Willert et al. (2003)Nature 423:448-452 描述了借助洗漆剂纯化 Wnt 蛋白的方法。Morrell et al. (2008)PLoS 0ne3 (8) : e2930描述了将Wnt蛋白构建到脂质体内，以及包裹在脂质体内的Wnt如何保持体内生物活性。专利公开包括美国专利号7，335，643和7，153，832和已公开的美国专利申请20080226707。专利技术概述提供了 Wnt组合物以及它们的使用方法。本专利技术的组合物包括具有期望的生物活性的wnt多肽片段,该片段在本文称为“小型wnt”。感兴趣的小型wnt多肽包括天然wnt蛋白和其衍生物的片段，例如，包括能提高目标性质的相对于天然序列的一个或多个氨基酸改变的类似物，所述性质例如溶解性、对目标受体的亲和力或特异性。所述片段，尤其是WntC末端的片段，可能是水溶性的。感兴趣的组合物包括，但不限于，配制于药学上可接受的赋形剂中的有效剂量的小型wnt多肽。组合物可以包括其它试剂，例如，佐剂等。小型wnt多肽可以通过合成方式产生，通过本领域已知的各种合适的重组方法等。这些组合物和方法在抑制表达Wnt受体的细胞内的Wnt信号转导，例如，用于抑制异常的细胞增殖；将功能部分（functional moiety),如治疗或成像部分,递送至表达Wnt受体的细胞；以及用作制备fct特异性抗体的免疫原中特别有用。通常小型wnt能结合Wnt共受体对的一个而非两个。在一些实施方案中，小型wnt为C末端（C-terminal)或“C末端（Cterm) ”小型wnt,其中C末端小型wnt为包含wnt多肽的羧基末端结构域或由wnt多肽的羧基末端结构域组成，且不包括氨基末端结构域的氨基酸残基的多肽。本文中以多个人fct蛋白为示例描述羧基末端结构域，例如，如图6中所示。还可以通过与本文中提供的序列比对而通过经验鉴定fct羧基末端结构域。在一个实例中，C末端小型wnt氨基酸序列通过保守残基与人Wntl的298-370位对齐，且缺少与人Wntl的1-257位残基对齐的氨基酸序列。C末端小型wnt通常为水溶性的。 在其它实施方案中，小型wnt为N末端（N-terminal)或“N末端（Nterm) ”小型wnt,其中N末端小型wnt为包含wnt多肽的氨基末端结构域或由wnt多肽的氨基末端结构域组成，且不包括羧基末端结构域的氨基酸残基的多肽。本文中以多个人fct蛋白为示例描述氨基末端结构域，例如，如图8中所示。还可以通过与本文中提供的序列比对而通过经验鉴定fct氨基末端结构域。在一个实例中，N末端小型wnt氨基酸序列通过保守的残基与人Wntl的34-247位对齐，且缺少与对应于人Wntl的288-370位残基的残基对齐的氨基酸序列。N末端小型wnt可以为水溶性的或者可以为脂溶性的。在一些实施方案中，小型wnt多肽与功能部分融合或缀合，功能部分可以为治疗性部分，例如细胞毒性部分，或将细胞定向为ADCC或CDC指导的细胞死亡的部分。感兴趣的治疗性部分包括能本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.01.28 US 61/462,1301.组合物，包含小型wnt多肽,其中所述小型wnt多肽为C末端小型wnt或N末端小型writ。2.权利要求1所述的组合物，其中所述小型wnt多肽为C末端小型wnt,其能结合Fz蛋白、ROR蛋白或Ryk蛋白，且不结合相应的Wnt共受体。3.权利要求2所述的组合物，其中所述C末端小型wnt为由图6中所示的C末端小型wnt氨基酸序列组成的多肽或其变体。4.权利要求2所述的组合物，其中所述C末端小型wnt通过保守残基与人Wntl的298-370位对齐，且缺少与人Wntl的1_257位残基对齐的氨基酸序列，或其变体。5.权利要求1所述的组合物，其中： 所述小型wnt多肽为N末端小型wnt,其能结合LRP5、LRP6或FRLl/crypto蛋白，且不结合相应的fct共受体。6.权利要求5所述的组合物，其中所述N末端小型wnt为由图8中所示的Wnt氨基酸序列组成的多肽或其变体。7.权利要求5所述的组合物，其中所述N末端小型wnt通过保守残基与人Wntl的34-247位对齐，且缺少与对应于人Wntl的288-370位残基的残基对齐的氨基酸序列，或其变体。8.如权利要求2-7中任一项所述的组合物，其中所述变体为截短形式。9.如权利要求2-7中任一项所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：柯南·克里斯托弗·加西亚，阿荣·莱文，
申请(专利权)人：莱兰斯坦福初级大学评议会，
类型：
国别省市：
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