一种防治拟松材线虫病的方法技术

本发明专利技术公开了一种防治拟松材线虫病的方法，该方法是将罗红霉采用注射法注入松树木质部，每年春、秋各一次。本发明专利技术对拟松材线虫病的防治效果显著。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，该方法是将罗红霉采用注射法注入松树木质部，每年春、秋各一次。本专利技术对拟松材线虫病的防治效果显著。【专利说明】
本专利技术涉及生物学领域，尤其涉及的是。
技术介绍
近年来在我国的许多非松材线虫疫区(重庆南山、福建邵武、四川等)的马尾松发生大面积死亡，但是死树中没有发现松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus),而是大量拟松材线虫(Bursaphelenchus mucronatus),确认了拟松材线虫对松树具有致病性,但它的致病机理目前还尚未有研究，其防治方法借签松材线虫病。研究表明体表消毒后的拟松材线虫单独致病性很弱，而拟松材线虫体表有大量附生微生物，这些微生物对马尾松的致病作用，特别是拟松材线虫体表携带的杓兰果胶杆菌产生非蛋白液对马尾松有强烈致病作用，杓兰果胶杆菌和线虫的共生是拟松材线虫致病的必要因素，也是杓兰果胶杆菌保持活力的必要条件。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供。本专利技术的技术方案如下:，是采用注射法将罗红霉素注入松树，每年春、秋各一次。`所述的方法，罗红霉素浓度为50-100 μ g/ml。所述的方法，在松树1.3m高处注射罗红霉素。所述的方法，罗红霉素注入深度达松树木质部。所述的方法，每株松树注入罗红霉素100mL。所述的方法，在松树的东、南、西、北方向各注射25ml罗红霉素。本专利技术对拟松材线虫病的防治效果显著。【具体实施方式】以下结合具体实施例，对本专利技术进行详细说明。1、拟松材线虫的获得与培养取某地云南松濒临枯死样木，利用贝尔曼漏斗分离法，分离得到线虫，运用形态学和分子生物学相结合的方法进行鉴定。将线虫接入生长有拟盘多毛孢(Pestalotiopsisheterocornis)的培养基中，25°C恒温培养,待该菌被吃光后，线虫置于4°C保存备用。2、线虫体表可培养微生物的分离、纯化对I中所得拟松材线虫进行体表微生物的分离。线虫用滴管吸I滴于玻片上，在显微镜下用移液器吸取单条线虫，将5-10条线虫置于凹玻片中用3%过氧化氢消毒Imin (除去腐生菌)，在显微镜下将线虫用灭菌的去离子水清洗3次后用移液枪接于PDA培养基上，置于25°C培养。细菌菌落出现，用平板划线分离法纯化细菌。将纯化的细菌移至NA (牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000ml，pH7.0，混匀分装后121°C高压灭菌30min)斜面上于4°C保存。真菌菌落出现时，挑取不同的菌落转接于PDA (土豆200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，蒸馏水1000ml，混匀分装后121°C高压灭菌30min)平板纯化。将纯化的真菌移至PDA斜面上于4°C保存。3、细菌16S RNA分类鉴定3.1DNA 提取利用TIANamp Bacteria DNA Kit细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)提取DNA。提取的DNA用1.5mLEP管置于-20°C保存。3.2PCR 反应选取细菌通用引物I 和 2，引物 1:5’ -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’，引物 2:5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACTT-3’，总 PCR 反应体系共 50 μ L，其中模板 6 μ L，引物 4 μ L，2XTCP PCR master mix25 μ L，去离子水15 μ L。设空白对照。反应条件为:94°C预变性5min，94°C 30s, 55°C lmin,72°C 2min，30 个循环，72°C延伸 IOmin03.3电泳检测取PCR产物5 μ L在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，180V, lh。凝胶成像系统观察照相，检测PCR产物大小。3.4测序鉴定将PCR产物直接送于天根生物检测公司，进行纯化，双向测序。将所得序列通过与NCBI数据库序列比对，构建遗传树，鉴定细菌。4、真菌ITS序列分析鉴定4.1DNA 提取菌丝长满平板后，用TIANamp Plant DNA Kit植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)提取DNA。DNA置于-20°C保存。4.2PCR 反应采用真菌核糖体基因转录间隔区(ITS)通用引物。ITSl:5’ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ 和 ITS4:5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。总 PCR 反应体系共50 μ L，其中模板 2 μ L，引物 4 μ L，2 X TCP PCR master mix25yL，去离子水 19 μ L。设空白对照。反应条件为:94°C预变性5min，94°C 30s, 55°C lmin，72°C 2min，30个循环，72°C延伸IOmin04.3测序鉴定电泳检测PCR产物后，将PCR产物直接送于英骏生物公司，进行纯化，单向测序。将所得序列通过与NCBI序列比对，鉴定真菌。通过分离纯化鉴定，从拟松材线虫体表共分离得到细菌26种，真菌4种，同一菌种由于基因型不同，命名为1、I1、III等，如枯草芽胞杆菌1、枯草芽胞杆菌I1、枯草芽胞杆菌II1、枯草芽胞杆菌IV、枯草芽胞杆菌V、枯草芽胞杆菌V1、枯草芽胞杆菌VII，详见表1。表1拟松材线虫体表可培养微生物体系【权利要求】1.，其特征是，采用注射法将罗红霉素注入松树，每年春、秋各一次。2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，罗红霉素浓度为50-100μ g/ml。3.根据权利要求1所述的方法，其特征是，在松树1.3m高处注射罗红霉素。4.根据权利要求1所述的方法，其特征是，罗红霉素注入深度达松树木质部。5.根据权利要求1所述的方法，其特征是，每株松树注入罗红霉素100mL。6.根据权利要求5所述的方法，其特征是，在松树的东、南、西、北方向各注射25ml罗红霉素O【文档编号】A01G13/00GK103493811SQ201310493103【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年10月21日 优先权日:2013年10月21日 【专利技术者】朱天辉, 朱涵明月, 李姝江, 张静, 韩珊, 谯天敏, 张丽娜 申请人:四川农业大学本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种防治拟松材线虫病的方法，其特征是，采用注射法将罗红霉素注入松树，每年春、秋各一次。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱天辉，朱涵明月，李姝江，张静，韩珊，谯天敏，张丽娜，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：