测定方法技术

本发明专利技术提供了用于确定样品中触珠蛋白水平的测定方法，所述测定方法包括以下步骤：(i)将血红蛋白与待测定样品混合以形成带有存在于所述样品中的触珠蛋白的触珠蛋白-血红蛋白复合物；(ii)在缓冲液存在的情况和以下条件下，将步骤(i)的产物与用于产生过氧化氢的试剂和当存在过氧化物酶活性时经历光谱可检测的变化的一种或多种色原接触；在所述条件中过氧化氢从所述试剂中产生并形成用于存在的触珠蛋白-血红蛋白复合物的过氧化物酶活性的底物，并且其中所述缓冲液的pH在足够低到任何未复合的血红蛋白的过氧化物酶活性基本被遏制但足够高到产生过氧化氢的范围内；(iii)通过测量所述反应混合物的光学性质的变化来确定所述触珠蛋白-血红蛋白复合物的过氧化物酶活性；和(iv)将所述触珠蛋白-血红蛋白复合物的过氧化物酶活性水平与所述样品中触珠蛋白的量关联。本发明专利技术还提供了用于此类方法的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术提供了用于确定样品中触珠蛋白水平的，所述包括以下步骤：(i)将血红蛋白与待测定样品混合以形成带有存在于所述样品中的触珠蛋白的触珠蛋白-血红蛋白复合物；(ii)在缓冲液存在的情况和以下条件下，将步骤(i)的产物与用于产生过氧化氢的试剂和当存在过氧化物酶活性时经历光谱可检测的变化的一种或多种色原接触；在所述条件中过氧化氢从所述试剂中产生并形成用于存在的触珠蛋白-血红蛋白复合物的过氧化物酶活性的底物，并且其中所述缓冲液的pH在足够低到任何未复合的血红蛋白的过氧化物酶活性基本被遏制但足够高到产生过氧化氢的范围内；(iii)通过测量所述反应混合物的光学性质的变化来确定所述触珠蛋白-血红蛋白复合物的过氧化物酶活性；和(iv)将所述触珠蛋白-血红蛋白复合物的过氧化物酶活性水平与所述样品中触珠蛋白的量关联。本专利技术还提供了用于此类方法的试剂盒。【专利说明】专利
本专利技术涉及用于确定样品中触珠蛋白水平的测定和试剂盒。特别地，本专利技术涉及易于适应于以干燥形式运行的用于确定触珠蛋白水平的测定，在所述形式中试剂在运行所述测定前在表面上干燥。专利技术背景 触珠蛋白是一群被称作急性期蛋白的蛋白之一，在感染、炎症或外伤后其浓度显著上升。因此测量血浆中触珠蛋白的浓度对样品所获自的人或动物的健康状况提供有价值的诊断信息，在本领域中在开发用于血浆、血清和其它生物流体中的触珠蛋白的测定方面已有相当兴趣。目前用于确定样品中触珠蛋白浓度的测定通常基于免疫测定或基于依赖于触珠蛋白结合血红蛋白的能力的血红蛋白结合。运用基于抗体的方法和特异性针对触珠蛋白的抗血清的免疫测定已经开发并且为本领域已知。通常，此类测定基于免疫比浊测定，触珠蛋白的浓度经由测量溶液中抗体-触珠蛋白沉淀物的形成来确定。酶联免疫吸附测定(ELISA)是此类测定的另一种常见实施方案。做此类免疫测定不仅需要抗血清的持续供给，而且试验必须对研究中的各个独立物种进行验证，使得基于免疫测定的方法商业吸引力较少。基于触珠蛋白结合血红蛋白的能力的测定现在常规用于兽医诊断实验室。其在经济上更可行，因为它们比基于抗体的方法需要更少昂贵的试剂并且还可对所有物种进行。在EP 1031035B1中描述了一种血红蛋白结合测定系统，其利用了触珠蛋白结合血红蛋白的内源活性。在低PH下，所得触珠蛋白-血红蛋白复合物保留了过氧化物酶活性，而未结合的血红蛋白的过氧化物酶活性是失活的。通过检测过氧化物酶的活性，可确定存在的复合的血红蛋白的量并从而可确定样品的触珠蛋白含量。在EP 1031035B1中所述的测定系统中，应用试剂例如蛋白结合抑制剂和有效针对二硫键的还原剂和/或离液剂以抑制在触珠蛋白的低血液浓度时干扰测定的血清血蛋白的过氧化物酶活性。与迄今描述的血红蛋白结合测定(例如以上论述的EP 1031035B1中所述的测定)相关的主要缺点，是需要过氧化氢作为用于所述触珠蛋白-血红蛋白复合物的过氧化物酶活性的底物。过氧化氢是高活性的并且需要稳定化以防止其氧化所述测定中的其它组分。这不仅限制了所述测定的实用性，而且还使所述测定不适于适应干燥化学形式，例如用于目测评价或基于仪器的评价的“试条(dip-stick) ”布置。US 4695552描述了在游离血红蛋白存在的情况下确定血红蛋白-触珠蛋白复合物的方法，所述方法涉及确定过氧化物酶的活性。但是，所述过氧化物酶活性的底物是过氧化氢。过氧化氢还作为试剂与3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺一起用于JP 2208568中所述的触珠蛋白确定方法中。因此仍有对克服现有技术相关问题的用于确定样品中触珠蛋白水平的改良测定的持续需要。专利技术简沭 本专利技术提供了用于确定样品中触珠蛋白水平的，所述方法包括以下步骤: (i)将血红蛋白与待测定样品混合以形成带有存在于所述样品中的触珠蛋白的触珠蛋白-血红蛋白复合物； (ii)在缓冲液存在的情况和以下条件下，将步骤(i)的产物与用于产生过氧化氢的试剂和当存在过氧化物酶活性时经历光学可检测的变化的一种或多种色原接触；在所述条件中过氧化氢从所述试剂中产生并形成用于存在的触珠蛋白-血红蛋白复合物的过氧化物酶活性的底物，并且其中所述缓冲液的PH在足够低到任何未复合的血红蛋白的过氧化物酶活性基本被遏制但足够高到产生过氧化氢的范围内； (iii)通过测量所述反应混合物的光学性质的变化来确定所述触珠蛋白-血红蛋白复合物的过氧化物酶活性；和 (iv)将所述触珠蛋白-血红蛋白复合物的过氧化物酶活性水平与所述样品中触珠蛋白的量关联。合适地，在以上方法中，步骤(i)和(ii)例如通过形成包含待测定样品、血红蛋白、用于产生过氧化氢的试剂、当存在过氧化物酶活性时经历光谱可检测变化的一种或多种色原和合适的缓冲液中的全部的反应混合物来同时进行。本专利技术还提供了用于本专利技术的触珠蛋白测定的试剂盒，其包含血红蛋白、用于产生过氧化氢的试剂、当存在过氧化物酶活性时经历光学可检测的变化的一种或多种色原和缓冲液。通过本专利技术，提供了用于确定样品中触珠蛋白水平的，其通过确定与所述触珠蛋白复合的血红蛋白的过氧化物酶活性来利用触珠蛋白结合血红蛋白的内源活性，但其避免了包含过氧化氢作为试剂以提供用于该过氧化物酶活性的底物的需要。其中过氧化氢底物在原位产生的触珠蛋白的无过氧化物测定的开发，是特别有利的，因为其避免了当不稳定并且高活性的过氧化氢直接用作试剂时加诸于测定上的实际限制，从而促进所述测定在广范围的情况和测定形式中的用途。专利技术详沭 本专利技术的可合适地对来自任何动物的血液样品，例如血浆或血清进行。或者，用于所述测定的样品可包含其它的生物流体例如腹水、滑液、脑脊液奶。在一个实施方案中，所述样品可获自包括人在内的哺乳动物。在一个实施方案中，所述样品中触珠蛋白的浓度为0.02 mg/ml-1.4 mg/ml。用于本专利技术的的血红蛋白可获自从中获得用于测定的样品的相同的动物，或者其可获自不同的物种。在一个实施方案中，所述血红蛋白为高铁血红蛋白。在本专利技术的中，所述样品中的触珠蛋白和添加的血红蛋白共同反应以形成触珠蛋白-血红蛋白复合物。在一个实施方案中，所述测定反应混合物孵育多至20分钟，例如5-20分钟。本专利技术方法的触珠蛋白-血红蛋白复合物的形成通过经由测量所述反应混合物光学性质的变化而确定所述复合物的过氧化物酶活性来检测。所述触珠蛋白-血红蛋白复合物的过氧化物酶活性的水平可接着与所述样品中触珠蛋白的量关联。 在本专利技术的中，所述触珠蛋白-血红蛋白复合物的过氧化物酶活性通过在所述测定中原位产生过氧化氢以形成用于所述复合物的过氧化物酶活性的底物并利用当存在过氧化物酶活性时经历光谱可检测的变化的色原检测所述过氧化物酶活性来确定。本专利技术用于产生过氧化氢的试剂合适地包含催化产生过氧化氢作为反应产物的反应的酶连同用于所述酶的底物。在本专利技术的一个实施方案中，所述用于产生过氧化氢的试剂包含葡萄糖氧化酶和底物葡萄糖。应理解的是可使用其它合适的酶/底物的组合以在所述测定中原位产生过氧化氢。可使用本领域常规的产生过氧化氢的任何酶/底物的组合例如胆固醇/胆固醇氧化酶或尿素/尿素氧化酶。当存在过氧化物酶活性时经历光谱可检测的变化的色原为本领域所熟知并描述于例如以上论述的EP 1031035B1中。用于测定本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：PD埃科萨尔，E麦库洛奇，S多彻尔蒂，
申请(专利权)人：反应实验室有限公司，
类型：
国别省市：