一种用于定量分析核酸的光导纤维传感器制造技术

本发明专利技术提供了平行对一种或多种核酸分子进行检测并实时定量分析的方法和装置，该方法和装置将固定有核酸探针的光导纤维嵌入到反应容器中，然后使光导入到光导纤维中，会在光导纤维表面形成倏逝场(evanescent?field)。倏逝场激发与光导纤维表面固定的探针相结合的目标产物上的荧光基团，而反应溶液中大量未结合的目标分子或是荧光基团几乎不被激发。通过检测荧光信号强度的变化来定量核酸分子的量。本发明专利技术的方法不需要多种荧光基团标记，不需要多个反应通道，因此成本低、检测的目标分子通量高。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供了平行对一种或多种核酸分子进行检测并实时定量分析的方法和装置，该方法和装置将固定有核酸探针的光导纤维嵌入到反应容器中，然后使光导入到光导纤维中，会在光导纤维表面形成倏逝场(evanescent?field)。倏逝场激发与光导纤维表面固定的探针相结合的目标产物上的荧光基团，而反应溶液中大量未结合的目标分子或是荧光基团几乎不被激发。通过检测荧光信号强度的变化来定量核酸分子的量。本专利技术的方法不需要多种荧光基团标记，不需要多个反应通道，因此成本低、检测的目标分子通量高。【专利说明】—种用于定量分析核酸的光导纤维传感器
本专利技术属于生物
；更具体地，本专利技术涉及在利用光导纤维(以下也简称光纤)传感器对核酸分子进行分析和检测的方法和装置。本专利技术的方法和装置可用于核酸的检测、基因诊断、基因序列分析、基因类型及多态性的分析、以及基因表达的分析等生物
，特别是在基因检测的实时定量聚合酶链式反应(Real time quality PCR)、连接酶反应和阵列化的核酸检测领域。
技术介绍
自从1985年，Kary Mullis专利技术聚合酶链式反应以来，聚合酶链式反应技术一下子成为了分子生物学发展以来最具影响力的技术革命之一。它使得核酸检测成为一种成熟的，高灵敏度，快速的检测技术，并且很快的广泛应用到分子生物学研究和微生物病原体体的临床检测中，包括真菌、细菌、病毒等的检测。Kary Mullis也因此于1993年获得了诺贝尔奖。但是，聚合酶链式反应后需要烦琐的DNA电泳检测，并且由此容易产生样品相互之间的交叉污染。使得聚合酶链式反应对技术操作人员以及实验室要求很高，而且检测的错误率很高。聚合酶链式反应最终在临床检测的应用受到了挑战。聚合酶链式反应可以结合上逆转录反应、连接酶反应等,使得聚合酶链式反应应用于核酸检测的多个方面。到二十世纪九十年代的中后期，在聚合酶链式反应技术和荧光技术基础上发展起来的实时定量聚合酶链式反应(Real time quality PCR)技术，实现了 PCR从定性到定量的飞跃，减去了 DNA电泳检测，使得操作简便了一些，并且省去了 DNA电泳检测的时间。同时也使得交叉污染的机率降低了，提高了检测的准确性，并且能够更准确的量化被检测的核酸分子。这一技术的检测线形范围能达到7-9个数量级，灵敏度能检测到低到几个拷贝的核酸分子，精确性可以达到小于3%的偏差。它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具，并且开始被临床检测所接受。临床微生物的检测是实时定量聚合酶链式反应技术现在在临床检测的最重要的领域，它比传统的临床微生物检测技术大大的缩短了检测时间，提高了检测的灵敏度，而且操作更加简便。目前，主要用于一些常见病毒，如HIV，HBV, HCV等的临床检测，或是难培养的细菌，如结核杆菌的检测上。在生命科学研究，特别是基因表达的定量分析上，实时定量聚合酶链式反应技术也有着非常广泛的应用。实时定量聚合酶链式反应技术同时也被应用在环境监测，公共卫生检测，生物武器检测等分析上。但是，很多核酸检测需要检测和定量的核酸分子不止一种。而实时定量聚合酶链式反应技术又恰恰难进行多种核酸的平行检测和定量分析。很多生物技术公司，包括ABI，Invitrogen等，或是生物技术研究室都在试图开发多通量的核酸平行检测和定量分析技术。这些多种核酸的实时定量聚合酶链式反应技术，或是通过用多种不同光谱的荧光分子来标记不同的探针分子来检测不同的核酸分子，或者是在多个反应管道中分别进行多个实时定量聚合酶链式反应。而这些技术或是要求多种不同光波段的荧光分子，或是需要高密度的反应管道，使得原先就已经比较昂贵的实时定量聚合酶链式反应技术，其试剂和仪器成本成倍的增长。而且，它们的检测通量受到了荧光分子种类和反应管道体积的限制。随着DNA芯片技术的兴起，平行地对多种核酸进行监测成为可能。但是生物芯片操作程序繁琐，人员要求高；检测重复性、准确性差；检测的时间长等因素，限制了芯片技术对多种核酸进行监测的应用。因此，本领域中迫切需要提供改进的、操作简便的能同时对多种核酸分子进行实时定量检测的方法。
技术实现思路
为了克服上述缺陷，专利技术人经过深入研究，建立了能同时对一种或多种核酸分子进行实时定量检测的方法。具体而言，本专利技术第一方面提供一种平行测定样品中多种核酸分子的存在或量的方法，该方法包括以下步骤:a)提供一反应容器，所述反应容器中包含待检测的核酸分子和核酸反应液，在所述反应容器中进行核 酸反应，反应中对核酸反应产物标记上突光基团；在所述反应容器内的的温度为可控，以控制所述核酸反应能在适宜的温度下进行。b)提供一根或多根光导纤维，在所述的光导纤维上固定了多种识别核酸探针分子;c)将所述光导纤维嵌入到反应容器中，使所述光导纤维上识别核酸探针分子与所述待检测的核酸分子和核酸反应液相接触；d)用一激发光源射入到所述光导纤维中，在所述光导纤维的表面产生倏逝场，使得与所述探针分子结合的所述核酸反应产物上的荧光基团被激发产生荧光信号；e)检测所述荧光信号的位置和强度，从而确定样品中核酸分子的存在或量。在一个优选例中，所述核酸探针分子通过化学键连接、物理吸附、聚合物包埋、蚀刻或粘联的方式固定在光纤纤芯的表面。在另一优选例中，所述倏逝场是通过在光纤内传导在光纤表面与核酸反应液的界面发生的光的全反射而产生。在另一优选例中，所述光导纤维为以全发射形式传导光的纤维状材料，其直径小于 Smnin在另一优选例中，所述的光导纤维的直径为0.01-5mm ;更佳地为0.05-lmm ;更佳地为 0.1-0.5mm。在另一优选例中，所述光导纤维的制作材料选自(但不限于):玻璃、石英、塑料或有机聚合物。在另一优选例中，所述的有机聚合物选自:聚乙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯。在另一优选例中，所述反应容器内壁上镀有厚度小于IOOOnm厚的金属膜，或者直径小于IOOOnm的金属颗粒(较佳地，金属颗粒在反应容器内壁的镀层厚度小于IOOOnm)，其中所述金属选自金、银、铜。在另一优选例中，所述光导纤维的材料为折射率大于核酸反应液的折射率的材料；较佳地，为折射率大于1.34的材料。在另一优选例中，所述的高折射率液体的折射率为1.34-2.0。在另一优选例中，所述核酸反应包括(但不限于):核酸连接酶反应、逆转录反应、核酸杂交反应、聚合酶链反应(PCR)等,或者这些反应的组合反应。本专利技术另一方面提供一种平行测定样品中多种核酸分子的存在或量的装置，该装置包括以下部分:a)提供一反应容器，所述反应容器中包含待检测的核酸分子和核酸反应液，在所述反应容器中进行核酸反应，反应中对核酸反应产物标记上突光基团；b)提供一根或多根光导纤维，在所述的光导纤维上固定了多种识别核酸探针分子;c)将所述光导纤维嵌入到反应容器中，使所述光导纤维上识别核酸探针分子与所述待检测的核酸分子和核酸反应液相接触；d) 一激发光源射入到所述光导纤维中，在所述光导纤维的表面产生倏逝场，使得与所述探针分子结合的所述核酸反应产物上的荧光基团被激发产生荧光信号；e) 一光信号检测器， 检测所述荧光信号的位置和强度，从而确定样品中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种平行测定样品中一种或多种核酸分子的存在或量的方法，该方法包括以下步骤：a)提供一反应容器，所述反应容器中包含待检测的核酸分子和核酸反应液，在所述反应容器中进行核酸反应，反应中对核酸反应产物标记上荧光基团；在所述反应容器内的的温度为可控，以控制所述核酸反应能在适宜的温度下进行；b)提供一根或多根光导纤维，在所述的光导纤维的纤芯表面上固定了多种识别核酸探针分子；c)将所述光导纤维嵌入到反应容器中，使所述光导纤维上识别核酸探针分子与所述待检测的核酸分子和核酸反应液相接触；d)用一激发光源射入到所述光导纤维中，在所述光导纤维的表面产生倏逝场，使得与所述探针分子结合的所述核酸反应产物上的荧光基团被激发产生荧光信号；e)检测所述荧光信号的位置和强度，从而确定样品中核酸分子的存在或量。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：许亮，
申请(专利权)人：许亮，
类型：发明
国别省市：