一种基于应用代谢组学对中药知柏地黄丸疗效的试验方法技术

本发明专利技术公开了一种基于应用代谢组学对中药知柏地黄丸疗效的试验方法，该方法包括：将实验动物分成对照组，糖尿病肾病模型组，糖尿病肾病给药组三组，进行注射处理并尿液、血清和肾脏组织样本；将三组大鼠的肾脏组织，用10％中性甲醛固定后石蜡包埋、切片，制片，常规苏木精-伊红染色后，在光学显微镜下观察肾脏组织病理学变化；血清样本和尿液样本化学指标的测定和组织病理学的检测；制备血清、尿液、肾脏的组织样本并获得1H?NMR谱的数据；采用统计学的方法，进行NMR数据处理与模式识别分析；对不同组大鼠的生理、生化重要指标进行对比分析。本发明专利技术通过代谢组学技术能获得机体大量的内源性代谢物的信息，筛选知柏地黄丸中有效成分引起的代谢物变化。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，该方法包括：将实验动物分成对照组，糖尿病肾病模型组，糖尿病肾病给药组三组，进行注射处理并尿液、血清和肾脏组织样本；将三组大鼠的肾脏组织，用10％中性甲醛固定后石蜡包埋、切片，制片，常规苏木精-伊红染色后，在光学显微镜下观察肾脏组织病理学变化；血清样本和尿液样本化学指标的测定和组织病理学的检测；制备血清、尿液、肾脏的组织样本并获得1H?NMR谱的数据；采用统计学的方法，进行NMR数据处理与模式识别分析；对不同组大鼠的生理、生化重要指标进行对比分析。本专利技术通过代谢组学技术能获得机体大量的内源性代谢物的信息，筛选知柏地黄丸中有效成分引起的代谢物变化。【专利说明】
本专利技术属于药品研究
，尤其涉及。
技术介绍
知柏地黄丸(Zhibai DihuangPill，ZDP)是一种常用中成药，是由补阴经典代表方剂六味地黄丸(熟地黄，山萸肉，山药，泽泻，牡丹皮和茯苓)加上知母和黄柏炮制而成，力口强了滋肾阴清相火的作用，近年来有人报道该药可以保护实验动物因糖尿病肾病导致的肾脏损伤，临床研究也发现联合服用化学药物和知柏地黄丸的病人其治疗效果要明显好于单独用化学药物的患者，可是，由于该药的多成分及其作用的多通路和多靶点，其作用机制仍不清楚，知柏地黄丸的作用机制，理论上应该是“多成分，多靶点”，但往往缺乏有效的试验方法和技术手段加以证明，其活性成分复杂，和通过多途径和多靶点对机体发挥作用的特点，这给研究中药防治疾病的确切的分子机制带来极大的困难。代谢组学是研究生物体内源性代谢物的整体及其受内在或外在因素影响的科学，其广泛的应用已深入到生物代谢、疾病诊断和药物整体药效毒性等研究领域，其“整体论”的哲学思想与中药作用的“多成分、多靶点”特征相一致，能从整体上评价知柏地黄丸“多成分，多靶点”的药效作用，并探讨其可能的作用机制。以往的试验方法沿用了化学药物(西药)研发常用的“单组份单靶点”理论模型和思路，其中心思想包括首先发现活性组份，进行分离鉴定，进而对活性成份或其化学衍生物进行药理、毒理、临床等方面的研究，尽管这种方法的研究取得了相当的成就。但是，也存在一些缺点:(I)知柏地黄丸中有多种有效成分，具有多种药物效应；(2)每个活性化合物组份可能有多个作用靶点，直接影响多个生物过程；(3)各个组份之间存在协同作用、相互影响，中药配伍的思想基础就是“协同作用”，单一的化学成分和药理指标不能对知柏地黄丸的药物效应清楚的认识；此外，许多单组分化学药物，不仅可以同时对不同的器官(如肝脏和肾脏)有效应。现有技术存在的不能对知柏地黄丸中多种有效成分进行测定和研究。
技术实现思路
本专利技术实施例的目的在于提供，旨在解决现有技术存在的不能对知柏地黄丸中多种有效成分进行测定和研究的问题。本专利技术实施例是这样实现的，一和基于应用代谢组学对中药知柏地黄丸疗效的试验方法，该基于应用代谢组学对中药知柏地黄丸疗效的试验方法包括以下步骤:步骤一，将实验动物分成对照组，糖尿病肾病模型组，糖尿病肾病给药组三组，进行注射处理并尿液、血清和肾脏组织样本；步骤二，将三组大鼠的肾脏组织，周10%中性甲醛固定后石蜡包埋、切片，制片，常规苏木精-伊红染色后，在光学显微镜下观察肾脏组织病理学变化；步骤三，血清样本和尿液样本化学指标的测定和组织病理学的检测；步骤四，制备血清、尿液、肾脏的组织样本并获得1H NMR谱的数据；步骤五，采用统计学的方法，进行NMR数据处理与模式识别分析；步骤六，对不同组大鼠的生理、生化重要指标进行对比分析；步骤七，对不同组大鼠进行代谢组学分析、血清样本中的代谢物分析、肾脏样本中的代谢物分析。进一步，在步骤一中，动物处理及样品收集的具体方法为:实验动物分为三组:对照组，糖尿病肾病模型组，糖尿病肾病给药组，除对照组外，所有动物腹腔注射STZ(70mg /kg)造成糖尿病模型，一个月后尿中蛋白的升高视为早期糖尿病肾病已形成，将这些糖尿病肾病大鼠随机分为2组:糖尿病肾病组和糖尿病肾病知柏地黄丸组，每组9只，糖尿病肾病知柏地黄丸组每天灌胃给予知柏地黄丸(4g / kg)，而糖尿病肾病组和对照组灌胃给予同样体积的溶剂，在STZ造模两个月后，所有的动物依次取尿液、血清和肾脏组织样本。进一步，在步骤二中，肾组织的组织学观察具体方法为:将三组大鼠的肾脏组织，用10%中性甲醛固定后石蜡包埋、切片，制片，常规苏木精-伊红染色后，在光学显微镜下观察肾脏组织病理学变化，半定量肾小管间质的病变，在200倍光学显微镜镜下，每张切片随机选择10个不连续视野，避开肾小球和大血管，肾间质病变由三个参数判定:肾小管扩张，间质炎症细胞浸润和间质纤维化程度。进一步，在步骤三中，血清样本的临床化学指标包括:甘油三酯、胆固醇和血糖值，尿液样本测定的是尿蛋白，组织病理学检测方法:随机选取25片组织切片，利用HE染色检测组织细胞的病理变化。进一步，在步骤四中，血清组织样本的制备具体方法为:将300 μ L解冻的血清与300 μ L磷酸缓冲液混合(0.2mol/LNa2HP04 / NaH2P04,pH7.4)，混合后的血清样本12000g离心lOmin，去除沉淀，随即将500 μ L上清液和含50 μ L重水转到5mmNMR管中，所有的NMR谱均在Varian Unity Inova核磁共振谱仪采集,配有三共振探头和Z轴脉冲梯度场,质子的共振频率为599.69MHz处，实验温度为25°C，针对血清样本，为减少大分子蛋白对谱宽的影响并保留小分子信号，利用一维CPMG脉冲序列采集样本的IH NMR谱。进一步，在步骤四中，尿液组织样本的制备具体方法为:将500 μ L解冻的尿液与50 μ L磷酸缓冲液混合(1.5mol / LK2HP04/NaH2P04，pH7.4)，混合时间150ms，混合后的血清样本12000g离心IOmin,去除沉淀,然后将500 μ L上清液和含2,2’，3, 3’_deuterotrimethylsilylproprionic acid(TSP, 1.5mmol / L)的 50 μ L 重水转到 5mm NMR管中，TSP 用于化学位移定标，所有尿液样本的NMR谱均在Varian Unity Inova600NMR谱仪采集，配有三共振探头和Z轴脉冲梯度场，质子的共振频率为599.69MHz，在25°C条件下利用一维NOESY脉冲序列采集尿液样本的IH NMR谱,所周的实验参数:混合时间(mixing time) 150ms,谱宽10000Hz，弛豫延迟2s，采样时间1.64s，数据采集点数16K，累加64次，FID充零至64K后,加0.5Hz窗函数进行Fourier变换。进一步，在步骤四中，肾脏组织的样本提取具体方法为:取冻存的部分肝组织样本称重后，在液氮条件下加冰冷的高氯酸溶液(12%，3mL / g组织)，用研钵碾至粉末状；离心去除沉淀后，用10% KOH调节pH值至中性；再次离心去除氯酸钾沉淀，将上清冻干至粉末状_80°C保存，在采集NMR谱之前，先用600 μ L含TSP和重水的磷酸缓冲液溶解粉末，离心，取500 μ L上清转移至5_ NMR样品管中，在25°C条件下周Varian Unity Inova NMR谱仪采集一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于应用代谢组学对中药知柏地黄丸疗效的试验方法，其特征在于，该基于应用代谢组学对中药知柏地黄丸疗效的试验方法包括以下步骤：?步骤一，将实验动物分成对照组，糖尿病肾病模型组，糖尿病肾病给药组三组，进行注射处理并尿液、血清和肾脏组织样本；?步骤二，将三组大鼠的肾脏组织，用10％中性甲醛固定后石蜡包埋、切片，制片，常规苏木精?伊红染色后，在光学显微镜下观察肾脏组织病理学变化；?步骤三，血清样本和尿液样本化学指标的测定和组织病理学的检测；?步骤四，制备血清、尿液、肾脏的组织样本并获得1H?NMR谱的数据；?步骤五，采用统计学的方法，进行NMR数据处理与模式识别分析。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：高红昌，赵良才，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：