本发明专利技术涉及一种转基因作物中新霉素磷酸转移酶(NPT?II)双抗体夹心ELISA定量检测方法，该检测方法是以体外条件下制备NPT?II蛋白为免疫原，制备兔抗NPT?II多克隆抗体为包被抗体，鼠抗NPT?II单克隆抗体作为捕获抗体，建立并优化了双抗体夹心ELISA方法，以系列含量的NPT?II蛋白作为标准，建立标准曲线，并对该方法各项指标进行验证。具体包括以下步骤：(1)NPT?II基因的克隆与表达；(2)抗NPTII蛋白单克隆抗体的制备；(3)抗NPTII蛋白多克隆抗体的制备；(4)双抗体夹心ELISA方法及标准曲线的建立；该方法灵敏度高、特异性强，并具有良好的重复性和稳定性，操作简单，适用于检测转基因作物中NPT?II含量。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种转基因作物中新霉素磷酸转移酶(NPT?II)双抗体夹心ELISA定量检测方法，该检测方法是以体外条件下制备NPT?II蛋白为免疫原，制备兔抗NPT?II多克隆抗体为包被抗体，鼠抗NPT?II单克隆抗体作为捕获抗体，建立并优化了双抗体夹心ELISA方法，以系列含量的NPT?II蛋白作为标准，建立标准曲线，并对该方法各项指标进行验证。具体包括以下步骤：(1)NPT?II基因的克隆与表达；(2)抗NPTII蛋白单克隆抗体的制备；(3)抗NPTII蛋白多克隆抗体的制备；(4)双抗体夹心ELISA方法及标准曲线的建立；该方法灵敏度高、特异性强，并具有良好的重复性和稳定性，操作简单，适用于检测转基因作物中NPT?II含量。【专利说明】转基因作物中新霉素磷酸转移酶(NPT II )双抗体夹心ELISA定量检测方法
本专利技术涉及分子生物学及生物
，具体涉及一种转基因作物中新霉素磷酸转移酶(NPT II )双抗体夹心ELISA定量检测方法。
技术介绍
自1983年第一例转基因植物问世以来，植物转基因技术为农业生产带来一场新的革命。它克服了传统育种的局限性，打破了物种间遗传壁垒，加快了种质改良进程，取得显著的经济和社会效益。全球转基因作物的种植面积持续扩大，转基因作物的品种也在不断增加。但转基因生物安全，尤其是含有抗生素基因的转基因作物的安全问题逐渐成为各国政府、科学界和社会公众关注的焦点。尽管现在的一些研究表明卡那霉素抗性基因是安全的，但有研究表明在叶围土壤中发现并证实了与NPT II基因序列同源性100%阳性片段，而认为转基因抗虫棉中的NPT II能够向叶围细菌漂移，所以尚不能对此下结论。而且世界上首例释放上市的转基因植物距今时间并不长，考虑到转基因产品风险的出现具有长期的滞后性，其长期效应如何、风险性可能有多大等问题目前还无法得出最终的结论，有必要对其进行长期的跟踪监测。
技术实现思路
为解决上述现有技术的不足，本专利技术建立了灵敏度高、特异性强、重复性良好、操作简单、快速的转基因作物中新霉素磷酸转移酶(NPT II )双抗体夹心ELISA定量检测方法，该方法速度快、高通量，能大大缩短检测周期，为转基因植物的检测提供保障，并能避免检测过程中可能造成的生物污染。为达到上述目的，本专利技术的技术方案为:转基因作物中新霉素磷酸转移酶(NPT II )双抗体夹心ELISA定量检测方法，包括如下步骤:(I) NPT II基因的克隆与表达；(2)抗NPT II蛋白单克隆抗体的制备；(3)抗NPT II蛋白多克隆抗体的制备；(4)双抗体夹心ELISA方法及标准曲线的建立；通过方阵滴定实验确定包被抗体的最佳包被浓度和酶标抗体的最佳稀释浓度并对ELISA条件进行摸索和优化，最终确定如下体系:①用0.1M碳酸盐缓冲液作为抗原包被液将兔多抗体稀释至1:2000 ; 100 μ L /孔包被ELISA板，4°C过夜；②用含0.05%Tween20的PBST洗涤液洗涤3次，每孔加入含5%脱脂奶粉的PBST溶液封闭液200 μ L，37°C封闭Ih ；③用PBST洗涤液洗涤3次后加入待检样品，IOOuL /孔，同时用阴性血清作对照，37 V反应Ih ；④3次洗涤后加入100 μ L单抗(1:2500)，37°C反应Ih ;⑤用PBST洗涤3次，加入I:5000稀释的HRP标记的兔抗鼠IgG，37°C反应lh，PBST洗涤3次，最后加入100 μ L可溶性TMB底物显色液，室温条件避光反应20min，用2MH2SOJ*止反应，利用酶标仪在450nm下测定吸光值，以抗原浓度为横坐标，以A / '(A为标准蛋白吸光度，Atl为阴性对照吸光度)值为纵坐标，绘制曲线图，根据曲线图最佳线性范围，建立标准曲线，通过标准曲线计算待测样品中NPTII蛋白浓度。所述抗NPT II蛋白单克隆抗体的制备方法为:①选择与骨髓瘤细胞Sp2 / O同源的4-6周龄纯系雌性BALB / c小鼠作为免疫动物；免疫方案:初次免疫为100 μ g纯化后的NPT II蛋白与等体积弗式完全佐剂乳化完全，小鼠背部皮下多点注射；3周和6周后，取IOOyg NPT II蛋白与等体积弗式不完全佐剂乳化完全，背部皮下多点注射作为第二、三次免疫；融合前四天，腹腔注射100μ g不加佐剂的NPT II蛋白，为加强免疫；②加强免疫4天后,取小鼠脾细胞与Sp2 / O骨髓瘤细胞利用PEG1500进行化学法融合，间接ELISA方法检测细胞培养板上的阳性孔，经过三次亚克隆，扩大培养并及时冻存稳定分泌抗NPT II蛋白的杂交瘤细胞株，并利用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒确定单克隆抗体的亚型；Western_blot验证单克隆抗体的特异性；③选择6—8周龄雌性BALB / c小鼠，腹腔注射弗式不完全佐剂0.5mL /只，一周后注射杂交瘤细胞0.5— I X IO6个/只，7—10天后收集腹水，300 Xg离心取上清，经间接ELISA方法检测腹水效价；腹水经正辛酸-硫酸铵方法纯化后，SDS-PAGE检测纯化效果。所述抗NPTII蛋白多克隆抗体的制备方法为；选择6只体重约2kg的健康新西兰大耳白兔作为免疫动物，在动物房观察饲养一周；初次免疫采用2mL浓度为Img / mL的免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合并充分乳化，大腿肌肉注射；以后换用弗氏不完全佐剂，每隔2周加强免疫一次，颈背部皮下多点注射；从第3次免疫后开始，每次免疫后7天左右，用ImL无菌注射器从耳边缘静脉取血0.5mL左右，间接ELISA法测定血清效价；当抗血清达到所需的效价时，最后一次加强免疫后7—10天，在无菌状态下颈动脉采全血；于室温下静置2h，再置4°C冰箱中过夜使之充分收凝，300 X g离心取血清，经正辛酸-硫酸铵方法纯化后，SDS-PAGE检测纯化效果；所述转基因植物为转基因棉花或木瓜。相对于现有技术，本专利技术的有益效果为:(I)灵敏度高:通过建立标准曲线可知，此双抗体夹心ELISA方法的最低检测限为1.97ng / mL。(2)特异性强:除NPT II阳性的植株蛋白提取液能检测到阳性的信号外，与PAT蛋白植株、CPTI蛋白植株、以及非转基因植株蛋白提取液等均无交叉反应。(3)重复性好:在线性范围内取108ng / mL、27ng / mL、6.75ng / mL3个浓度点，采用与标准曲线同时测定的方法，在一次实验中每个浓度点测10孔，计算批内变异系数。连续测10批次，计算批间变异系数。该检测方法的批内变异系数为(6.58±0.99) %，批间 变异系数为(7.33±1.15) %，满足批内精密度小于10%，批间精密度小于15%的要求。【专利附图】【附图说明】图1本专利技术所述转基因作物中新霉素磷酸转移酶(NPT II )双抗体夹心ELISA定量检测方法的标准曲线。以抗原浓度为横坐标，以A / Α0(Α为标准蛋白吸光度，AO为阴性对照吸光度)值为纵坐标。图2样品浓度的自然对数与A / Α0(Α为检测样品蛋白吸光度，AO为阴性对照吸光度)之间的线性方程。【具体实施方式】下面结合附图和具体实施例对本专利技术方法做进一步详细说明，但下文所述不用来限制本专利技术范围，凡本领域技术人员在本专利技术精神及实质下，对本专利技术方法，条本文档来自技高网...
【技术保护点】
转基因作物中新霉素磷酸转移酶(NPT?II)双抗体夹心ELISA定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)NPTII基因的克隆与表达；(2)抗NPTII蛋白单克隆抗体的制备；(3)抗NPTII蛋白多克隆抗体的制备；(4)双抗体夹心ELISA方法及标准曲线的建立；通过方阵滴定实验确定包被抗体的最佳包被浓度和酶标抗体的最佳稀释浓度并对ELISA条件进行摸索和优化，最终确定如下体系：①用0.1M的碳酸盐缓冲液作为抗原包被液将兔多抗体稀释至1：2000；100μL／孔包被ELISA板，4℃过夜；②用含0.05％Tween20的PBST溶液洗涤3次，每孔加入含5％脱脂奶粉的PBST溶液封闭液200μL，37℃封闭1h；③用PBST洗涤液洗涤3次后加入待检样品，100μL／孔，同时用阴性血清作对照，37℃反应1h；④3次洗涤后加入100μL单抗(1：2500)，37℃反应1h；⑤用PBST洗涤3次，加入1：5000稀释的HRP标记的兔抗鼠IgG，37℃反应1h，PBST洗涤3次，最后加入100μL可溶性TMB底物显色液，室温条件避光反应20min，用2M?H2SO4终止反应，利用酶标仪在450nm下测定吸光值，以抗原浓度为横坐标，以A／A0(A为标准蛋白吸光度，A0为阴性对照吸光度)值为纵坐标，绘制曲线图，根据曲线图最佳线性范围，建立标准曲线，通过标准曲线计算待测样品中 NPTII蛋白浓度。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：柴同杰，王新桐，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：
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