稳定沉默PKM2基因表达的结肠癌细胞株的制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种稳定沉默PKM2基因表达的结肠癌细胞株的制备方法，包括人PKM2基因的shRNA慢病毒表达载体的构建，慢病毒的包装、收获，DLD1结肠癌细胞慢病毒感染，稳定细胞株嘌呤霉素筛选和Real-time?PCR、Western?blot鉴定。实验结果证明，shRNA寡核苷酸序列可成功插入pLKO.1-puro表达载体中，且对PKM2基因表达的抑制效果显著、持续且稳定。制得的细胞株为研究PKM2在大肠癌细胞能量代谢、增殖、迁移和炎症等恶性特征中的调控作用提供实验材料。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供了一种稳定沉默PKM2基因表达的结肠癌细胞株的制备方法，包括人PKM2基因的shRNA慢病毒表达载体的构建，慢病毒的包装、收获，DLD1结肠癌细胞慢病毒感染，稳定细胞株嘌呤霉素筛选和Real-time?PCR、Western?blot鉴定。实验结果证明，shRNA寡核苷酸序列可成功插入pLKO.1-puro表达载体中，且对PKM2基因表达的抑制效果显著、持续且稳定。制得的细胞株为研究PKM2在大肠癌细胞能量代谢、增殖、迁移和炎症等恶性特征中的调控作用提供实验材料。【专利说明】稳定沉默PKM2基因表达的结肠癌细胞株的制备方法和应用
本专利技术涉及基因工程
，具体是一种稳定沉默PKM2基因表达的结肠癌细胞株的制备方法，以及得到的细胞株在研究PKM2调控大肠癌细胞能量代谢、增殖、迁移和炎症等恶性特征中的应用。
技术介绍
葡萄糖代谢异常是肿瘤细胞的一个重要特征。肿瘤细胞即使在有氧存在的情况下，也主要通过糖酵解而不是氧化磷酸化进行代谢，消耗大量葡萄糖并产生乳酸，即“Warburg效应”。越来越多的研究认为，糖酵解过程中产生的许多中间产物能够被肿瘤细胞所用，以合成蛋白质、核酸及脂类等生物大分子，为肿瘤细胞的生长和增殖提供必需的物质基础。 丙酮酸激酶(pyruvate kinase, PK)是糖酵解途径中一个重要的限速酶,催化磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮酸转化。在哺乳动物细胞中，存在PKM1、PKM2、PKL和PKR四种同工酶，其中PKL和PKR由相同的基因PKL编码，通过不同的组织特异性启动子而分别表达于肝脏和红细胞中；PKM1和PKM2由PKM基因编码，是前体mRNA经不同选择性剪切的产物，PKMl包含外显子9，主要表达于骨骼肌和脑组织；PKM2包含外显子10，主要表达于胚胎组织以及增殖的细胞，尤其是肿瘤细胞中。研究表明，肿瘤细胞特异性高表达PKM2在促进肿瘤细胞“Warburg效应”中发挥重要作用。PKM2可以通过调控糖酵解、磷酸戊糖和丝氨酸合成途径为肿瘤细胞提供大量增殖所必须的中间产物。此外，PKM2还具有重要的信号转导功能，它参与调控P-catenin、HIF-1a、NF-K B等重要信号促进肿瘤细胞对微环境的适应。然而，PKM2是否对肿瘤其它恶性特征发挥作用目前还不清楚。本专利技术通过慢病毒转染获得PKM2稳定低表达细胞株，为进一步探讨PKM2在肿瘤细胞能量代谢及其它恶性特征中的调控作用提供了有力工具。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种稳定沉默PKM2基因表达的DLDl稳定细胞株，为研究PKM2在大肠癌细胞能量代谢、增殖、迁移和炎症等恶性特征中的调控作用提供实验材料。本专利技术提供一种稳定沉默PKM2基因表达的DLDl稳定细胞株的制备方法，包括如下步骤:(I) shRNA寡核苷酸序列的设计:根据PKM2基因的mRNA全序列，经Blast同源性比对证实特异性后应用RNA Structure4.4软件对革E mRNA序列的二级结构进行评估得到革巴核苷酸序列，设计并合成靶向PKM2基因的shRNA寡核苷酸序列:SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2；(2) shRNA慢病毒表达载体的构建和鉴定:将合成的shRNA寡核苷酸:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2等量混合，退火形成双链的shRNA，同时双酶切pLK0.1-puro载体，电泳，切胶回收载体，用T4DNA连接酶将双链shRNA连接到载体pLK0.Ι-puro上，转化大肠杆菌感受态，克隆扩增获得pLK0.l-puro-shPKM2重组质粒，重组质粒经双酶切、DNA测序鉴定；(3) DLDl稳定细胞株的构建与筛选:培养HEK-293T细胞，并接种到IOOcm的培养皿中，待细胞长到70%时，pLK0.l-puro-shPKM2重组质粒与慢病毒包装质粒pMD2.G、psPAX2以质量比4:3:1共转染HEK-293T细胞；培养48h、72h后分别收集含病毒的上清培养基，合并后用于感染生长状态良好的DLDl细胞，用浓度为6 μ g/mL的puiOmycin筛选出单细胞克隆，并扩大培养，采用Real-time PCR和Western blot技术分别从mRNA和蛋白水平验证PKM2基因的抑制效果。实验结果证明本专利技术提供的shRNA寡核苷酸序列可成功插入pLK0.l_puro表达载体中，且对PKM2基因表达的抑制效果显著、持续且稳定。相比对照细胞，本专利技术得到的稳定沉默PKM2基因表达的结肠癌细胞株中谷氨酰胺代谢相关酶及受体的基因表达量均上升，说明沉默PKM2基因的表达引起了细胞谷氨酰胺的代偿作用。【专利附图】【附图说明】图1为重组质粒pLK0.l-puro-shPKM2双酶切鉴定结果示意图。图2为嘌呤霉素筛选细胞后荧光定量PCR检测结果示意图。图3为嘌呤霉素筛选细胞后Western Blot检测结果示意图。图4为稳定细胞株谷氨酰胺代谢相关酶及受体的基因表达的检测结果示意图。图5为MTT法检测稳定细胞株谷氨酰胺的代偿作 用的结果示意图。【具体实施方式】下面结合附图与具体实施例对本专利技术做进一步说明。实施例1(I)靶向PKM2基因的shRNA寡核苷酸序列的设计在GenBank查找到PKM2基因的mRNA全序列(NM-001206796)，经Blast同源性比对证实特异性后应用RNA Structure4.4软件对祀mRNA序列的二级结构进行评估，最后筛选得到一条21nt靶核苷酸序列:SEQ ID NO:5, CGGGTGAACTTTGCCATGAAT，靶点位置为946-966。根据靶核苷酸序列设计合成一条shRNA的DNA模板单链，命名为shRNAl，另外再设计一对对照序列shRNAc，具体序列见表I。设计的shRNA寡核苷酸链由上海英骏生物技术有限公司合成。 表I靶向PKM2基因的shRNA寡核苷酸序列【权利要求】1.一种稳定沉默PKM2基因表达的结肠癌细胞株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: Cl)根据PKM2基因的mRNA全序列，经Blast同源性比对证实特异性后应用RNAStructure4.4软件对祀mRNA序列的二级结构进行评估得到祀核苷酸序列，设计并合成靶向PKM2基因的shRNA寡核苷酸序列:SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 ; (2)将合成的shRNA寡核苷酸序列:SEQID NO:U SEQ ID NO:2等量混合，退火形成双链的shRNA，同时双酶切pLK0.1-pur ο载体，电泳，切胶回收载体，用T4DNA连接酶将双链shRNA连接到载体pLK0.1-pur ο上，转化大肠杆菌感受态，克隆扩增获得pLK0.l-puro-shPKM2重组质粒，重组质粒经双酶切、DNA测序鉴定； (3)培养HEK-293T细胞，并接种到培养皿中，待细胞长到70%时，pLK0.l-puro_shPKM2重组质粒与慢病毒包装质粒PMD2.G、psPAX2以质量比4:3:1共转染HEK-293T细胞；培养48h、72h后分别收集含病毒的上清培养基，合并后用于感染生长状态良好的DLDl细胞，用浓度为6 μ g/mL的puromycin筛选出单细胞克隆,并扩大培养即可。2.如权利要求1所述的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种稳定沉默PKM2基因表达的结肠癌细胞株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）根据PKM2基因的mRNA全序列，经Blast同源性比对证实特异性后应用RNAStructure4.4软件对靶mRNA序列的二级结构进行评估得到靶核苷酸序列，设计并合成靶向PKM2基因的shRNA寡核苷酸序列：SEQ?ID?NO：1，SEQ?ID?NO：2；（2）将合成的shRNA寡核苷酸序列：SEQ?ID?NO：1、SEQ?ID?NO：2等量混合，退火形成双链的shRNA，同时双酶切pLKO.1?puro载体，电泳，切胶回收载体，用T4DNA连接酶将双链shRNA连接到载体pLKO.1?puro上，转化大肠杆菌感受态，克隆扩增获得pLKO.1?puro?shPKM2重组质粒，重组质粒经双酶切、DNA测序鉴定；（3）培养HEK?293T细胞，并接种到培养皿中，待细胞长到70%时，pLKO.1?puro?shPKM2重组质粒与慢病毒包装质粒pMD2.G、psPAX2以质量比4：3：1共转染HEK?293T细胞；培养48h、72h后分别收集含病毒的上清培养基，合并后用于感染生长状态良好的DLD1细胞，用浓度为6μg/mL的puromycin筛选出单细胞克隆，并扩大培养即可。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李卓玉，武海丽，李宗伟，杨鹏，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：