一种高效提取绿豆α-淀粉酶抑制剂的方法技术

本发明专利技术公开了一种高效提取绿豆α-淀粉酶抑制剂的方法，所述方法是采用凝胶柱层析和乙醇沉淀从绿豆中提取并纯化出组分均一的α-淀粉酶抑制剂，同时就绿豆α-淀粉酶抑制剂提取条件对猪胰α-淀粉酶抑制活性的影响做了分析，确定了绿豆α-淀粉酶抑制剂的最佳提取工艺条件。按照本发明专利技术方法提取的绿豆α-淀粉酶抑制剂对温度具有较高的稳定性，因此在开发为一种安全、天然的降糖药物中有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种高效提取绿豆α-淀粉酶抑制剂的方法
本专利技术涉及一种绿豆α-淀粉酶抑制剂的提取方法，具体说，是涉及一种以效率高，产物温度稳定性高而著称的绿豆α-淀粉酶抑制剂的提取方法。
技术介绍
随着人们生活水平的提高和平均寿命的延长，无论是发达国家还是发展中国家，肥胖、糖尿病等疾病患者都在逐年增加，减肥、降血糖等相关研究受到了越来越高的重视。由于绿豆α-淀粉酶抑制剂(α-AmylaseInhibitor，α-AI)是一种糖苷水解酶抑制剂，它通过抑制肠道内唾液及胰淀粉酶的活性，阻碍食物中碳水化合物的消化吸收，选择性地减少糖分摄取，降低血糖和血脂的含量，减少脂肪的合成，进而起到降糖、减肥及预防肥胖的功效。国外α-AI研究起步较早，早在上世纪四十年代就有小麦种子中α-AI的报道。它是一种电迁移率为0.2，分子量为21kDa的蛋白质。但在随后的二十五年间很少有这方面的报道。直到上世纪七十年代，由于它在医学上的价值，α-AI才成为研究的热点。绿豆(Vignaradiatα)又名青小豆，因其颜色青绿而得名，它是一种豆科、蝶形花亚科豇豆属植物，根据营养专家分析，绿豆的预防疾病指数为245.93，证明绿豆对疾病的康复具有相当高的价值。绿豆供食用，亦可提取淀粉，制作豆沙、粉丝等；也可入药，有清凉解毒、利尿明目之效。常食绿豆，对高血压、动脉硬化、糖尿病、肾炎有较好的治疗辅助作用。此外，绿豆还可以作为外用药，嚼烂后外敷治疗皮肤湿疹。当前，已经从微生物(主要集中在链霉菌属)、小麦、玉米、豆类、野生苋属等植物种子中分离得到α-AI，它的分子量大小在9～63kDa。目前国内从小麦中提取α-AI的研究比较多，但从绿豆中提取α-AI，尤其是抑制活性高的，尚未见报道。此外，现有技术中α-AI大都采用传统的加热溶剂浸提法制备，在提取过程中加热至53℃以上，容易导致部分淀粉发生糊化，溶液粘度增大，给后续离心分离操作带来障碍；并且长时间加热会降低产品的生物活性。提取过程中，由于工艺限制，原料不能粉碎过细，导致细胞壁的破碎度降低，不利于细胞中α-AI完全释放，需要消耗大量提取溶剂进行长时间萃取。因此传统的加热溶剂浸提法在制备α-AI时，具有提取时间长、生产成本高等缺点。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术的目的是提供一种以效率高，产品温度稳定性高而著称的绿豆α-淀粉酶抑制剂的提取方法。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种高效制备绿豆α-淀粉酶抑制剂的方法，其特征在于：采用凝胶柱SephedexG-75层析和乙醇沉淀从绿豆中提取并纯化出组分均一的α-淀粉酶抑制剂。作为一种优选方案，所述的制备方法具体包括如下步骤：a)将脱脂绿豆粉在35～50℃温度范围浸泡4～20小时，然后粉碎制成100目以下的细粉；经搅拌，12000g,4℃，离心30min去渣；b)用凝胶柱SephedexG-75提取，即先以HAc-NaAc缓冲液平衡凝胶柱，再将步骤a)离心后取得的上清液加入HAc-NaAc缓冲液至终浓度为0.02mol/L,以0.5mL/min流速上样，再以HAc-NaAc缓冲液洗脱提取，收集蛋白峰并逐管测定淀粉酶抑制剂活性，收集活性峰洗脱液，与预先放置于-20℃的乙醇，按照1∶1～1∶3体积比混合，-20℃沉淀，提取时间即第一次SephedexG-75提取收集活性峰洗脱液与乙醇沉淀-20℃放置的时间，范围为1～2h。c)12000g，室温离心20min，去除上清液，清洗并减压干燥后制得α-AI粗提品；d)将α-AI粗提品溶于适量的HAc-NaAc缓冲液中，再使用SephedexG-75凝胶柱，先利用HAc-NaAc缓冲液平衡凝胶柱，再将溶有α-AI粗提品的HAc-NaAc缓冲液上样，流速为0.5mL/min，以HAc-NaAc缓冲液洗脱，流速为0.5mL/min，得到一蛋白主峰，逐管检测淀粉酶抑制活性，进而收集活性峰，经透析、浓缩后减压干燥，获得纯度较高的α-AI。作为进一步优选方案，所述步骤b)中HAc-NaAc缓冲液浓度为0.02mol/L，pH为4.0。作为进一步优选方案，所述步骤d)中HAc-NaAc缓冲液浓度为0.02mol/L，pH为4.0。绿豆α-AI化学构成测定，糖类含量测定采用苯酚-H2SO4法，蛋白质含量测定采用Bradford法，结果纯化后的绿豆α-AI的化学组成为：蛋白质含量为84.7％，多糖类含量为15.3％。结果表明，绿豆α-AI成分主要是由蛋白质组成的糖蛋白。绿豆α-AI活性测定，采用3，5二硝基水杨酸比色法，即Bernfeld法，通过3，5二硝基水杨酸与还原糖反应显示出红棕色，在波长546nm处比色，由于α-AI对淀粉水解有抑制作用，可使A546值下降，从而可计算待测物对淀粉酶活性的抑制率。本专利技术制得α-AI抑制活性为50.1～77.5IU/g。本专利技术绿豆α-AI提取方法具有简单、操作控制容易、提取率高、稳定性好的特点；制得绿豆α-AI对温度有一定强度的稳定性，安全无毒，可以有效地预防和治疗糖尿病，作为天然的降糖药物具有良好的开发前景。附图说明图1为本专利技术的工艺流程图图2为绿豆粉浸泡时间对抑制率的影响曲线图图3为绿豆粉浸泡温度对抑制率的影响曲线图图4为绿豆粉提取时间对抑制率的影响图曲线图5为原料乙醇添加比例对抑制率的影响曲线图图6为绿豆α-淀粉酶抑制剂对温度的稳定性曲线图具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步详细、完整地说明。本专利技术中所使用试剂与仪器如下：脱脂绿豆粉：购自河南省信阳市绿园食品科技有限公司；粒径为200目猪胰α-淀粉酶(PPA)(比活力150U/mg)：本实验室自制；SephedexG-75：Whatman公司；蓝淀粉：Sigma公司；其它试剂均为国产分析纯。HH-S11-2型电热恒温水浴锅：无锡建仪实验器材有限公司；752型分光光度计：江苏姜堰市光大仪器厂；BSZ-100型自动部分收集器、紫外检测仪：上海青浦沪西仪器厂；5415D型离心机：Eppendorf公司。FW80型高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司SephedexG-75凝胶柱：规格：1.0cmx30cm；Whatman公司实施例1将5×0.1kg脱脂绿豆粉在40℃分别浸泡4h、8h、12h、16h、20h，然后分别利用高速万能粉碎机制成100目以下的磨粉，经搅拌，12000g,4℃，离心30min去渣；凝胶柱SephedexG-75提取：分别使用0.02mol/L，pH为4.0HAc-NaAc缓冲液平衡凝胶柱，再将前一步离心后取得的上清液加入HAc-NaAc缓冲液至终浓度为0.02mol/L,以0.5mL/min流速上样，再以0.02mol/L，pH为4.0的HAc-NaAc缓冲液洗脱提取，收集蛋白峰并逐管测定淀粉酶抑制活性，收集活性峰洗脱液，与预先放置于-20℃的乙醇，按照1∶1体积比混合，-20℃沉淀，提取时间即第一次SephedexG-75提取收集活性峰洗脱液与乙醇沉淀-20℃放置的时间，为1.5h；12000g，室温离心20min，去除上清液，清洗并减压干燥后制得α-AI粗提品；将五种α-AI粗提品溶于适量的HAc-NaAc缓冲液中，再分别使用SephedexG-75凝胶柱，先以0.02mol/LpH4.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效制备绿豆α?淀粉酶抑制剂的方法，其特征在于：采用凝胶柱SephedexG?75层析和乙醇沉淀从绿豆中提取并纯化出组分均一的α?淀粉酶抑制剂。

【技术特征摘要】
1.一种制备绿豆α-淀粉酶抑制剂的方法，其特征在于，所述的制备方法包括如下步骤：a)将脱脂绿豆粉在35～50℃温度范围浸泡4～20小时，然后粉碎制成100目以下的细粉；经搅拌，12000g，4℃离心30min去渣；b)用凝胶柱SephedexG-75提取，即先以HAc-NaAc缓冲液平衡凝胶柱，再将步骤a)离心后取得的上清液加入HAc-NaAc缓冲液至终浓度为0.02mol/L，以0.5mL/min流速上样，再以HAc-NaAc缓冲液洗脱提取，收集蛋白峰并逐管测定淀粉酶抑制剂活性，收集活性峰洗脱液，与预先放置于-20℃的乙醇，按照1∶1～1∶3体积比混合，-20℃沉淀，提取时间即第一次SephedexG-75提取收集活...

【专利技术属性】
技术研发人员：王琦，王荣，侯沁文，雷海英，
申请(专利权)人：王琦，
类型：发明
国别省市：