一种促进麻疯树外植体再生不定芽的方法技术

本发明专利技术属于植物生物技术领域，具体地，公开了一种促进麻疯树外植体再生不定芽的方法。所述方法改变了传统的麻疯树外植体再生不定芽的方法，即在诱导不定芽再生的培养基中不添加激素，而是利用高浓度的苯基噻二唑基脲溶液对各种来源的麻疯树外植体进行短期浸泡处理，给予外植体细胞短期但高强度的激素刺激，由此促使部分细胞以更高的效率直接再分化形成更多的不定芽。应用本发明专利技术所述方法可以显著提高麻疯树外植体不定芽的再生效率和质量。此外，本方法外植体无需经过常规的愈伤组织形成和不定芽增殖阶段，因此可显著缩短再生培养周期，使麻疯树相关生物技术育种的工作效率得到相应的大幅度的提高。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术属于植物生物
，具体地，公开了。所述方法改变了传统的麻疯树外植体再生不定芽的方法，即在诱导不定芽再生的培养基中不添加激素，而是利用高浓度的苯基噻二唑基脲溶液对各种来源的麻疯树外植体进行短期浸泡处理，给予外植体细胞短期但高强度的激素刺激，由此促使部分细胞以更高的效率直接再分化形成更多的不定芽。应用本专利技术所述方法可以显著提高麻疯树外植体不定芽的再生效率和质量。此外，本方法外植体无需经过常规的愈伤组织形成和不定芽增殖阶段，因此可显著缩短再生培养周期，使麻疯树相关生物技术育种的工作效率得到相应的大幅度的提高。【专利说明】
本专利技术涉及植物生物
，具体地，涉及。
技术介绍
伴随着全球对化石燃料的需求日益增长，存储的化石燃料即将耗尽，人们越来越关注可再生的生物柴油。在可产生生物柴油的候选植物中，属于大戟科的麻疯树CZairoAacurcas L.)具有明显的优势，它的种子含油量高，种仁含油量可达40%飞0%，同时，麻疯树油中含有活性成分多，如毒蛋白、麻疯酮等有着重要的农药和医药价值。然而，大力推广麻疯树的种植却面临一系列问题，虽然麻疯树种子中含油量高，但种子产量不高；种油中活性成分多，但仍需要改变油的成分才能直接替代化石燃料；麻疯树对环境要求较高，耐寒能力弱，分布区域较窄。麻疯树属包括175个种，可以通过种间杂交引入优良性状，但所需周期长，不能够获得特异的外源基因，故主要通过基因转化改变遗传背景。高频率的植株再生体系是基因转化的基础。麻疯树外植体根据来源不同可以分为不同的类型。从成年麻疯树植株上直接获得叶片、叶柄经处理后可以得到成年植株叶片外植体、成年植株叶柄外植体。将麻疯树种子进行无菌培养得到的无菌苗，从无菌苗上得到无菌下胚轴、无菌子叶叶片和无菌子叶叶柄，经处理后可以得到无菌下胚轴外植体、无菌子叶叶片外植体和无菌子叶叶柄外植体。将麻疯树种子经常规培育、萌发得到的萌发苗，从萌发苗上可以得到下胚轴和真叶叶柄，经处理后可以得到种子苗下胚轴外植体和真叶叶柄外植体。现有技术中诱导麻疯树外植体再生不定芽时，通常是在麻疯树外植体不定芽再生培养基中添加细胞分裂素，而最常用的细胞分裂素为6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)，浓度为2 mg/1 ;6-糠氨基嘌呤(6-KT)，浓度为0.1-1.0 mg/1或苯基噻二唑基脲(TDZ)，浓度为0.05、.5 mg/1。在这种条件下叶柄外植体的不定芽再生效率很低，芽体的质量也较差。同时，这些再生体系均存在周期长(80 d以上)、再生率不高的问题，严重制约了麻疯树遗传转化研究的开展。
技术实现思路
本专利技术为了克服现有技术麻疯外植体再生不定芽时再生率低、再生芽体质量差、再生周期长的缺陷，提供。所述方法简便，可以显著缩短整个培养周期，而且通过所述的方法可以得到数量更多、质量更好的不定芽。本专利技术通过以下技术方案予以实现上述目的: ，其特征在于，包括如下步骤: 51.获得麻疯树外植体； 52.将步骤SI中的麻疯树外植体用10-60mg/1苯基噻二唑基脲(TDZ)溶液浸泡处理5?40 min ；S3.将步骤S2处理后的麻疯树外植体以横放方式接种至无激素的培养基上培养； 所述横放方式为将外植体的横切面与培养基的水平表面相垂直； 所述麻疯树外植体为成年植株叶片外植体、无菌下胚轴外植体、无菌子叶叶片外植体、无菌子叶叶柄外植体、种子苗下胚轴外植体或真叶叶柄外植体。麻疯树外植体根据来源不同可以分为不同的类型。从成年麻疯树植株上直接获得叶片、叶柄经处理后可以得到成年植株叶片外植体、成年植株叶柄外植体。将麻疯树种子进行无菌培养得到的无菌苗，从无菌苗上得到无菌下胚轴、无菌子叶叶片和无菌子叶叶柄，经处理后可以得到无菌下胚轴外植体、无菌子叶叶片外植体和无菌子叶叶柄外植体。将麻疯树种子经常规培育、萌发得到的萌发苗，从萌发苗上可以得到下胚轴和真叶叶柄，经处理后可以得到种子苗下胚轴外植体和真叶叶柄外植体。优选地，所述无菌下胚轴外植体用20 mg/1苯基噻二唑基脲溶液浸泡处理20 min。优选地,所述成年植株叶片外植体或无菌子叶叶片外植体用20 mg/1苯基噻二唑基脲溶液浸泡处理40 min。优选地，所述无菌子叶叶柄外植体或真叶叶柄外植体用20 mg/1苯基噻二唑基脲溶液浸泡处理20 min。同时，专利技术人在前期研究工作中发现:从成年麻疯树植株上获得的成年植株叶柄外植体最适合的处理方式为用3 mg/1苯基噻二唑基脲溶液浸泡处理5 min,不定芽的再生效果最好。本专利技术同时也发现:而种子苗下胚轴外植体不适宜采用苯基噻二唑基脲溶液浸泡处理的方法来诱导不定芽再生。由此可以看出:不同类型的麻疯树外植体的细胞的分裂能力各异，不同类型的麻疯树外植体对TDZ的敏感性也不同，决定了其再生不定芽的难易程度不同，所以，不是所有类型的麻疯树外植体都可以采用这种方法来诱导不定芽再生。优选地，所述成年植株叶片外植体或无菌子叶叶片外植体在以横放方式接种至无激素的培养基上培养时，采用叶片下表面朝上的接种放置方式，其不定芽的再生效果比较好。所谓叶片下表面朝上的接种放置方式就是说让叶片的上表面紧贴培养基表面，叶片下表面朝上。步骤S2的TDZ溶液采用一般方法配制成所需即可，具体地，可以采用如下方法配制:称取一定量的TDZ粉末，用lmol/1 NaOH充分溶解，再用去离子水定容，采用I mol/1HCl溶液调整TDZ处理溶液的pH至5.8飞.0 ;使用前用0.22微米的水系滤膜对已配制好的TDZ处理溶液进行过滤灭菌。所述不同类型的麻疯树外植体的制备方法可以参考本
常规方法得到即可。优选地，步骤S3中所述培养的条件为:光照强度为200-2500 lx，光照时间为12-16小时/天，培养温度为25±1°C。本专利技术的创造点在于先用高浓度的激素短暂处理，再用无激素的培养基培养再生不定芽，无激素培养基的种类对本专利技术来说不是着重点，只要是不含激素，而且能够为不定芽的再生提供充足营养成分的培养基都可以实现本专利技术。优选地，本专利技术步骤S3中所述无激素的培养基以无激素的MS培 养基为主要成分。另外，所述无激素的培养基还含有25-35g/Ι蔗糖、8(Tl20 mg/1肌醇和6-8 g/Ι琼脂；培养基pH为5.8-6.0。所述培养基并不限定本专利技术的保护范围。传统麻疯树外植体不定芽再生培养方法之所以存在不定芽再生效率很低，芽体的质量差、周期长的缺陷，首先是因为长时间培养外植体不能够用高浓度的细胞分裂素，因为长期高浓度激素培养外植体将导致外植体受伤甚至死亡，而低浓度的细胞分裂素的刺激不定芽再生的作用又不够强。其次是在不定芽形成以后残存在培养基和外植体组织中的细胞分裂素对不定芽的进一步生长有十分不利的影响。本专利技术对通常的麻疯树外植体不定芽再生培养方法进行了创新，即在诱导不定芽再生培养基中都不添加TDZ，取而代之的是利用高浓度的TDZ溶液对麻疯树外植体进行短期的浸泡处理，给予外植体具有分化能力的细胞相对于普通添加TDZ的培养基更强的刺激，诱导形成更多的不定芽。同时，由于仅是局部短时的浸泡处理，TDZ在细胞中的浓度随后很快降低，减少了在培养后期对所形成的不定芽的发育的负面影响，可以达到一次培养操作就可以得到完整植株的高效目的。本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种促进麻疯树外植体再生不定芽的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.获得麻疯树外植体；S2.将步骤S1中的麻疯树外植体用10~60?mg/l苯基噻二唑基脲溶液浸泡处理5~40?min；S3.将步骤S2处理后的麻疯树外植体以横放方式接种至无激素的培养基上培养；所述横放方式为将外植体的横切面与培养基的水平表面相垂直；所述麻疯树外植体为成年植株叶片外植体、无菌下胚轴外植体、无菌子叶叶片外植体、无菌子叶叶柄外植体或真叶叶柄外植体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘颖，杨跃生，刘振兰，庄楚雄，李静，童欣，惠文凯，陈晓阳，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：