检测乙型肝炎病毒耐药基因的RCA方法技术

本发明专利技术公开了一种检测乙型肝炎病毒耐药基因的RCA方法，按照如下步骤完成：（1）HBV基因组PCR扩增；（2）单次RCA，再用1.0%的琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪观察电泳结果。本发明专利技术锁式探针结合RCA技术是一种检测基因位点突变的新方法，通过锁式探针特异识别靶基因的点突变位点，RCA扩增放大检测信号。该方法不需特殊设备、操作简单、特异性好、灵敏度高，在病原体耐药位点突变检测方面具有独特优势。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种检测乙型肝炎病毒耐药基因的RCA方法，其特征在于，按照如下步骤完成：(1)、HBV基因组PCR扩增：a、提取HBV基因组：1)、在1.5ml螺旋盖离心管中加入0.1ml血清样品和0.6ml?Qlysis?V?Reagent，振荡30s混匀后室温放置10min；2)、将0.7ml异丙醇加入到步骤1)所得的混合溶液中，振荡30s混匀后，15000g室温离心15min；3)、将步骤2)所得的离心产物移弃上清液，再加入1.0ml70％乙醇，振荡数秒后15000g室温离心5min；4)、将步骤3)所得的离心产物移弃上清液，再加入100ul去离子水，反复吹打离心管官底和管壁的膜状沉淀，使其溶解，?20度保存备用；b、PCR扩增HBV基因组：引物RT?F5′?CGTGAAGCTTGACTCGTGGTGGACTTCTCTCA?3′???????????SEQ?NO1；引物RT?R5′?ATATGGTACCGGCATTAAAGCAGGATAACCACATTG?3′??????????SEQ?NO2；1)、PCR扩增体系30ul：2)、PCR循环体系：继续按以下参数PCR循环扩增：取制得的PCR扩增产物用3.0％的琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪观察电泳结果；(2)、单循环RCA：a、锁式探针的环化连接与酶切：去离子水12μl、1μMol/L的锁式探针2μl、步骤(1)制得的PCR产物2μl和10×E.coli?Buffer2μl，混匀，95℃变性5min，45℃孵育40min后，加入10×BSA缓冲液2μl和0.2μl?E.coli?DNA连接酶，混匀，37℃进行环化连接反应40min；再加入10×Exonuclease?I?Buffer2μl和Exonuclease?I核酸外切酶2μl，混匀，37℃反应1h，最后在95℃条件下灭活Exonuclease?I核酸外切酶；b、RCA扩增：取步骤a中制得的探针环化连接产物24μl、加入100μmol/L引物1μl和10×phi29Buffer3μl，95℃5min，冰浴1min；加入phi29DNA聚合酶1μl、dNTP液1μl，混匀后37℃进行RCA反应2h；c、取步骤b制得的扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪观察电泳结果；所述步骤(2)中所设计用于RCA反应的引物是：引物5′?ATGGGCACCGAAGAAGCA?3′??????SEQ?NO3；探针是：锁式探针5′?CCTACGAACCACTGAACTGCTTCTTCGGTGCCCATACATCAAATGCCACGTTAACAG?TCAGGCCTAGTGGGGGAAAGC?3′，探针的5′端进行磷酸化修饰??????SEQ?NO4。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张波，林钟劝，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：