用于肿瘤病理诊断的试剂盒及对组织切片进行染色的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于肿瘤病理诊断的试剂盒，包括用于肿瘤病理诊断的探针；探针包括金纳米簇、肿瘤特异性标志物的抗体及考马斯亮蓝，金纳米簇与肿瘤特异性标志物的抗体通过点击化学方式连接，考马斯亮蓝与连接有肿瘤特异性标志物的抗体的金纳米簇通过静电方式结合；其中，金纳米簇、肿瘤特异性标志物的抗体及考马斯亮蓝的摩尔比为1～10:1～100:1～100。该试剂盒对肿瘤病理诊断具有较高准确性。此外，本发明专利技术还提供一种对组织切片进行染色的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学
，特别是涉及一种用于肿瘤病理诊断的试剂盒及采用用于肿瘤病理诊断的试剂盒对组织切片进行染色的方法。
技术介绍
近廿年来，肿瘤死亡率急剧上升。在35至59岁的中壮年人群中，肿瘤已列居各类死因之首。有数据显示:我国肿瘤发病率约为200/10万人，每年新发病例约220万人以上，在治疗的患者约600万人以上。肿瘤已成为造成我国最佳劳动力损失、医疗费用上涨的一大原因。尽管已经研究出了一些预防肿瘤的化学药物，但至今仍没有一种有效控制肿瘤的一级预防措施。所以，当前乃至将来相当长一段时间内，早期诊断仍是肿瘤防治的一项基本策略。肿瘤特异性标志物检测是临床上检查肿瘤的重要手段之一，主要包括非常成熟的免疫组织化学染色(immunohistoehemicalstaining, IHC)、免疫突光技术(Immunofluorescence technique, IF)、突光原位杂交(fIuoreseeneeinsituhybridization, FISH)和显色原位杂交(ehromogenieinsitu hybridization, CISH)。 IHC和IF检测的是细胞膜上肿瘤特异性标志物的表达情况，而FISH和CISH则是通过检测HERJZ基因扩增的水平来对癌症进行检测。这些方法对离体肿瘤组织及细胞特异性标志物的检测已经得到广泛的认可，在某种程度上较好的满足了乳腺癌等肿瘤的临床诊疗需求。但是，由于这些方法要用到天然的过氧化物酶和有机荧光染料，而天然的过氧化物酶容易变性和失活，且提纯困难、价格昂贵，储藏和使用不便，成本高。有机荧光染料的荧光容易萃灭，导致检测结果易出现假阴性等不准确的诊断结果。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种对肿瘤病理诊断具有较高准确性的用于肿瘤病理诊断的试剂盒。一种用于肿瘤病理诊断的试剂盒，包括用于肿瘤病理诊断的探针；所述探针包括金纳米簇、肿瘤特异性标志物的抗体及考马斯亮蓝，所述金纳米簇与所述肿瘤特异性标志物的抗体通过点击化学方式连接，所述考马斯亮蓝与所述连接有所述肿瘤特异性标志物的抗体的金纳米簇通过静电方式结合；其中，所述金纳米簇、所述肿瘤特异性标志物的抗体及所述考马斯亮蓝的摩尔比为I 10:1 100:1 100。在其中一个实施例中，所述点击化学方式连接为所述金纳米簇表面修饰的叠氮基与所述肿瘤特异性标志物的抗体表面修饰的炔基发生点击化学反应而连接。在其中一个实施例中，所述金纳米簇的粒径为0.5 2nm。在其中一个实施例中，所述肿瘤特异性标志物的抗体为乳腺癌的抗HER2蛋白抗体、乳腺癌的抗P53蛋 白抗体、乳腺癌的抗pl85蛋白抗体、肺癌的CEA单克隆抗体或抗人肺癌单克隆抗体(McAb) N-35。在其中一个实施例中，所述试剂盒中还包括封闭剂、过氧化氢及核染剂。在其中一个实施例中，所述封闭剂为正常的山羊血清、牛血清白蛋白或牛奶粉。在其中一个实施例中，所述核染剂为DAPI或Hoechst。由于金纳米簇具有近红外荧光特性，而且还具有尺寸小、生物相容性好等特性，从而金纳米簇可以作为生物荧光探针。而考马斯亮蓝具有肉眼可视化的特性，可以用于免疫组化检测中。将肿瘤特异性标志物的抗体通过点击化学方式连接到金纳米簇上，而考马斯亮蓝通过静电方式结合到连接有肿瘤特异性标志物的抗体的金纳米簇上，从而得到上述用于肿瘤病理诊断的探针。该探针具有优异的化学和物理性能，粒径小，比表面积大，悬浮稳定性好，对肿瘤具有很强的靶向性。将上述试剂盒用于肿瘤病理诊断时，由于金纳米簇具有近红外荧光特性，在激发光的作用下发荧光，实现对肿瘤细胞的荧光定位。而由于考马斯亮蓝具有肉眼可视化的特性，上述探针通过抗原抗体特异性结合到肿瘤细胞上，并洗涤掉没有结合的探针，即可通过肉眼得出结果，不要使用仪器设备，即可实现对肿瘤细胞的可见光定位。从而上述试剂盒能实现对肿瘤细胞的双重共定位，不仅增加了单张切片的信息含量，还可初步判断由污点造成的非特异性荧光着色，更利于综合的分析判断实验结果，可增加实验的可信度和说服力，从而有助于及时、正确地做出病理诊断。而且上述试剂盒中不需要包含一抗、酶(荧光染料)标二抗及显色剂等，从而将上述试剂盒用于肿瘤病理诊断时，具有操作更简便，工作量更少等特点，能有效节约成本。更为免疫组化和免疫荧光的相互转化与衔接提供技术和思维平台。一种使用上述试剂盒对组织切片进行染色的方法，包括如下步骤:将冰冻组织切片或预先 经脱蜡水化处理后的石蜡组织切片依次浸泡于无水乙醇、质量分数为95%的乙醇溶液以及质量分数为70%的乙醇溶液中，每次5分钟，然后用PBS洗涤；在组织切片上滴加体积分数为3%的过氧化氢溶液，室温静置10分钟，并经PBS洗涤；将组织切片放入至95°C枸橼酸钠缓冲溶液中恒温浸泡10 15分钟，并经PBS洗涤，其中，枸橼酸钠缓冲溶液的浓度为0.01mol/L ；在组织切片上滴加封闭剂，于室温下封闭20分钟后，甩去多余液体；在组织切片上滴加所述用于肿瘤病理诊断的探针，室温下静置I小时、4°C过夜或者37°C下静置I小时，并经PBS洗涤，其中，所述探针的终浓度为0.01 10mmol/L;在组织切片上滴加核染剂，然后于37°C下孵育7 10分钟，使核染剂的终浓度为0.1 10 i! g/ml，并经PBS或自来水洗涤；封片，然后镜检。上述染色的方法具有操作更简便，工作量更少等特点，能有效节约成本，且能快速检测肿瘤组织切片。附图说明图1为实施例1中制备得到的用于肿瘤病理诊断的探针的表征图，其中，图1a为可见光下的表征图，图1b为紫外灯下的表征图2为实施I中的可见光定位的镜检图；图3为实施I中的荧光定位的镜检图；图4为实施I的对比例I中的镜检图；图5为实施I的对比例2中的镜检图；图6为实施2中的可见光定位的镜检图；图7为实施2中的荧光定位的镜检图；图8为实施2的对比例I中的镜检图；图9为实施2的对比例2中的镜检图。具体实施例方式下面结合附图及具体实施例对用于肿瘤病理诊断的试剂盒及染色的方法进行进一步的说明。一实施方式的用于肿瘤病理诊断的试剂盒，包括用于肿瘤病理诊断的探针。探针包括金纳米簇、肿瘤特异性标志物的抗体及考马斯亮蓝。金纳米簇与肿瘤特异性标志物的抗体通过点击化学方式连接，考马斯亮蓝与连接有肿瘤特异性标志物的抗体的金纳米簇通过静电方式结合。其中，金纳米簇、肿瘤特异性标志物的抗体及考马斯亮蓝的摩尔比为I 10:1 100:1 100。 在本实施方式中，金纳米簇是采用牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum,BSA)可控合成的。合成的金纳米簇由2 30个金原子构成,粒径为0.5 2nm,尺寸均一，近似球形，具有蛋白外壳，且具有高度分散性的纳米材料。因此，上述金纳米簇具有良好的生物相容性，且具有近红外荧光特性。从而金纳米簇可以作为生物荧光探针。在其他实施方式中，也可以采用人血清白蛋白来合成金纳米簇。其中，金纳米簇的摩尔数根据BSA的摩尔数来确定。采用紫外分光光度法来确定BSA的摩尔数，具体过程如下:配制浓度为1.0mg/mL的BSA溶液，并于280nm处测定紫外吸收。绘制标准曲线:取6支试管，并给每支试管标号，分别为试管1、试管2......试管6，并在6支试管中分别加入配制好的BSA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于肿瘤病理诊断的试剂盒，其特征在于，包括用于肿瘤病理诊断的探针；所述探针包括金纳米簇、肿瘤特异性标志物的抗体及考马斯亮蓝，所述金纳米簇与所述肿瘤特异性标志物的抗体通过点击化学方式连接，所述考马斯亮蓝与所述连接有所述肿瘤特异性标志物的抗体的金纳米簇通过静电方式结合；其中，所述金纳米簇、所述肿瘤特异性标志物的抗体及所述考马斯亮蓝的摩尔比为1～10:1～100:1～100。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡林涛，胡德红，盛宗海，方胜涛，高笃阳，王亚楠，龚萍，张鹏飞，
申请(专利权)人：深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：