本发明专利技术公开了一种全人源化抗PD-1单克隆抗体，它具有序列表中序列7所示的重链氨基酸序列和序列表中序列8所示的轻链氨基酸序列。本发明专利技术的优点在于该抗体对PD-1有很高的亲和力和很低的免疫原性，在动物细胞中高效表达，可用于工业化生产。实验证明，本发明专利技术的全人源化抗PD-1单克隆抗体特异性阻断PD-1/PD-L抑制信号可以使机体中失能的效应性细胞恢复生物学功能，促进肿瘤和病毒特异性CD8+T细胞的活化增殖与细胞因子的分泌，增强淋巴细胞对肿瘤抗原、外来入侵的病毒等的杀伤力，提高机体免疫力，及时清除肿瘤细胞和病毒。所以，本发明专利技术所述抗体对肿瘤、感染性疾病及自身免疫性疾病的治疗具有广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及抗体以及抗体药物开发和生产领域，尤其是涉及获得抗人ro-1的全人源化单克隆抗体，本专利技术还涉及该单克隆抗体的制备方法及应用。
技术介绍
PD-1 (⑶279)是由288个氨基酸组成的免疫球蛋白超家族I型跨膜糖蛋白，最初是从凋亡的小鼠T细胞杂交瘤2B4.11克隆，被认为与细胞凋亡相关而命名为程序性死亡-1 (programmed death-1, PD-1)0最初发现时，因其结构类似于⑶28分子，PD-1被认可是⑶28超家族成员。然而ro-Ι蛋白因缺乏介导⑶28/CTLA-4与B7.1/B7.2相结合的MYPPPY序列，以及介导ICOS与ICOS-L相结合的FDPPPF序列，因而在结构上与⑶28、CTLA-4及ICOS存在明显差异。因此，PD-1与配体的结合非常特异，不与其他的B7家族分子产生交叉结合。PD-Ll (B7-H1，CD274)和 PD-L2 (B7-DC，CD273)是 PD-1 的两个配体，它们同属B7超家族，因而同其它成·员一样，在蛋白结构上PD-Ll和PD-L2分子包含有IgV样区、IgC样区、跨膜区和一个短而保守的胞浆区尾部。ro-Li在活化的T、B、单核细胞和多种类型的肿瘤细胞(如:肺癌、肝癌、乳腺癌、鳞状细胞癌及卵巢癌等)上诱导性表达。ro-L2的蛋白表达谱相对于PD-Ll要窄得多，主要表达于活化的巨噬细胞、树突状细胞、骨髓来源的基质细胞和个别肿瘤细胞株上。大量的研究表明，PD-Li与活化的τ细胞上ro-1相互作用可显著抑制效应性T细胞的生物学功能，PD-1、ro-Ll或PD-L2的表达改变导致PD-1/PD-L抑制途径发生异常，进而机体发生免疫功能亢进/低下性疾病，ro-ι基因敲除小鼠可引发多种自身免疫性疾病。研究表明，PD-1信号通路也参与病毒性及微生物感染性疾病的进程。在HIV、HCV及HBV慢性感染患者体内发现病毒特异性的细胞毒性T细胞(CTL)为ro-1阳性，这群PD-1阳性的CTL位于记忆性的T细胞并具有活化标志，但不能分泌IFN-Y及穿孔素等抗病毒效应分子，表现出“功能裳竭”的特征。此外，PD-1的表达与病毒载量呈正相关。而阻断ro-1信号则可逆转CTL的“功能衰竭”状态并清除病毒。在人源化的BLT小鼠身上发现，阻断ro-ι信号可促进针对HIV病毒特异性的细胞及体液免疫。此外，在恒河猴的模型中，发现阻断ro-ι信号可促进针对SIV病毒特异性的细胞免疫及抗体的产生。这些结果都证实阻断ro-1信号有可能应用于Hiv等病毒感染的临床治疗。肿瘤细胞表达的肿瘤抗原能够被宿主T细胞识别，却不能被及时地有效清除，肿瘤微环境中的抑制因素一方面削弱T细胞功能，另一方面促进肿瘤细胞迅速生长。研究发现，ro-1/PD-Li抑制途径与肿瘤的发生、发展密切相关。研究发现，ro- LI广泛表达于各种肿瘤细胞，并通过PD -1/PD- LI途径诱导肿瘤的免疫逃避。PD - LI阳性的黑色瘤细胞诱导人⑶8 + CTL克隆凋亡的增加，几乎所有H) - LI阴性细胞在培养过程得到消除。将特异性针对HLA - B7限制性CEA表位的CTL克隆与CEA阳性乳腺癌细胞(组成表达PD - LI)进行共培养，使用抗PD - LI的单抗部分抑制特异性CTL的凋亡。因此，PD-1/PD-LI抑制途径对CD8+T细胞的活化增殖有明显的抑制作用，肿瘤细胞可通过此途径逃避CTL杀伤作用，减弱机体抗肿瘤免疫应答。H) - LI过度表达可能抑制肝癌组织内T细胞功能，促进肝癌细胞逃避免疫监控，并能显著增加人肝细胞性肝癌的恶化及术后的复发率。同时，利用抗PD-Ll单克隆抗体阻断ro-1/PD-Ll信号可以通过上调IFN-Y、IL-2、IL-10的分泌，有效逆转⑶4+和⑶8+T细胞的增殖受抑，同时T细胞的活化程度和杀伤能力显著增强。综上所述，通过特异性阻断PD-1/H)-L抑制信号可以使机体中失能的效应性细胞恢复生物学功能，促进肿瘤和病毒特异性CD8+T细胞的活化增殖与细胞因子的分泌，增强淋巴细胞对肿瘤抗原、外来入侵的病毒等的杀伤力，提高机体免疫力，及时清除肿瘤细胞和病毒。因此，PD-1/ro-L有望成为肿瘤免疫治疗的有效靶分子，也为HIV和HBV等慢性病毒感染性疾病及自身免疫性疾病的治疗提供一个新的策略。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种对人ro-1分子具有高亲和力和低解离速率的全人源化抗ro-1单克隆抗体，该抗体从构建的大容量天然人源噬菌体抗体库中筛选获得；本专利技术还提供该抗体的制备 方法，并公开了该抗体在制备治疗抗肿瘤、抗感染及自身免疫性疾病治疗药物中的用途。为实现上述目的，本专利技术可采取下述技术方案: 本专利技术的全人源化抗ro-Ι单克隆抗体，它具有序列表中序列7所示的重链SEQ IDN0.7氨基酸序列和序列表中序列8所示的轻链SEQ ID N0.8氨基酸序列。本专利技术的抗体分子的重链和轻链为全人源的，尽管嵌合的或人源化的也可以使用，但是在用于人体时，全人源的可以避免很多副作用，如HAMA和HACA反应引起的那些副作用。本专利技术的全人源化抗ro-1单克隆抗体，其重链可变区含有的三个高变区为:SEQID N0.1:GFTFSSYDYYMH、SEQ ID N0.2:VIWYSGSNTYYNDSLKS和 SEQ ID N0.3:AYFGVDV;轻链可变区含有的三个高变区为:SEQ ID N0.4:RASQGIGNTLA、SEQ ID N0.5:RASQGIGNTLA 和 SEQ ID N0.6:QQYDHVPLT。本专利技术的抗体包括由上述重链和轻链通过二硫键形成全长的抗体，以及形成的Fab、Fab'、F(ab' ) 2或Fv片段等抗体片段。本专利技术还公开了所述抗体的宿主细胞为中华仓鼠卵巢细胞(CH0)，小仓鼠肾细胞(BHK)，COS细胞，小鼠NSO胸腺瘤细胞等哺乳动物细胞。本专利技术全人源化抗ro-1单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤: a、从噬菌体人源抗体库筛选获得高亲和力全人源抗ro-1单链抗体； b、构建全人源抗ro-1完整抗体分子真核表达载体； C、全人源抗ro-1完整抗体分子在CHO细胞中的表达； d、全人源抗ro-1完整抗体分子的纯化及活性测定。本专利技术所述的全人源化抗ro-1单克隆抗体可用来制备抗肿瘤(包括高表达ro-1的肺癌、肝癌、乳腺癌、鳞状细胞癌、卵巢癌、结直肠癌、胃癌、胃肠道间质瘤、膀胱癌、甲状腺癌、黑色素瘤、颈癌、前列腺癌)药物、抗感染(感染性疾病包括HIV、HBV, HCV等病毒感染引起的疾病)药物及用来制备自身免疫性疾病(包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性脉管炎、银屑病、多发性硬化症、溃疡性结肠炎)治疗的药物，其制备方法是以全人源化抗PD-1单克隆抗体为主要成分，加上制药学上可接受的辅料和/或添加剂，经过冻干处理，制备成药学上可接受的药剂。本专利技术的优点在于该抗体对ro-1有很高的亲和力和很低的免疫原性，在动物细胞中高效表达，可用于工业化生产。实验证明，本专利技术的全人源化抗ro-1单克隆抗体特异性阻断PD-1/ro-L抑制信号可以使机体中失能的效应性细胞恢复生物学功能，促进肿瘤和病毒特异性CD8+T细胞的活化增殖与细胞因子的分泌，增强淋巴细胞对肿瘤抗原、外来入侵的病毒等的杀伤力，提本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种全人源化抗PD?1单克隆抗体，其特征在于：它具有序列表中序列7所示的重链SEQ?ID?NO.7氨基酸序列和序列表中序列8所示的轻链SEQ?ID?NO.8氨基酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：方惠敏，张守涛，张一折，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：
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