本发明专利技术提供一种针对转化生子因子βⅡ型受体的核酸适配子纳米制剂。该核酸适配子纳米制剂为由壳聚糖和核酸适配子组成的球形微粒，壳聚糖包裹核酸适配子，其中壳聚糖与核酸适配子的摩尔比大于20∶1；所述核酸适配子纳米制剂的粒径为100～300nm，电位为+4～+28mV；所述核酸适配子为Seq58。本发明专利技术还提供所述核酸适配子纳米制剂的制备方法。本发明专利技术针对转化生子因子βⅡ型受体的核酸适配子纳米制剂能竞争性地抑制TGF-β与其受体TβRⅡ结合，并具有良好的血清稳定性及缓释性，有望成为抗青光眼滤过术后瘢痕形成及防治其他纤维化相关疾病的新型生物工程药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程药物和药剂学领域，特别是涉及一种针对转化生子因子β II 型受体(transforming growth factor- β receptor II , T β R II )的核酸适配子纳米制剂 CS (Seq58)-NP (chitosan (Seq58)-nanoparticle)及其制备方法。
技术介绍
青光眼是一种常见的不可逆性致盲眼病，是人类的第二大致盲性疾病，病理性眼压升高是其主要特点。 目前临床上主要使用药物、激光和手术治疗的方法来降低眼压。滤过性手术被证明是适合于药物降眼压无效患者的最佳手术方法。与其它手术不同，青光眼滤过术后并不希望伤口完全修复，而是形成不完全愈合，以便房水外流，但该手术失败率高达15%-30%，主要原因是滤过通道瘢痕的形成。针对青光眼滤过手术后瘢痕的形成，目前主要的对抗手段是术中、术后采用抗瘢痕药物，临床上应用较广泛的是抗代谢药丝裂霉素C (mitomycin, MMC)、5_氟尿卩密唳(5-f luorouracil, 5_Fu)等,这类药物能有效提高青光眼术后的早期滤过，但其毒副作用不容忽视，常出现较多的并发症，如滤过泡渗漏、角膜上皮缺损、持续性低眼压等。因此，寻找一种疗效好、特异性强且毒副作用小的抗瘢痕药物已成为近年来青光眼研究的热点。研究发现，瘢痕化的发生及发展与多种致纤维化因子的活性密切相关，如TGF-β、FOGF、FGF、VEGF 等，其中转化生长因子 β (transforming growth factor-β , TGF-β )占主要地位，其亚型TGF-β 2在眼部瘢痕疾病的发生中又起主要作用。TGF-β与其受体TiiRII (转化生子因子β II型受体)结合作为始动环节，促使成纤维细胞转分化为具有收缩功能的肌成纤维细胞，在瘢痕化的发生中起着关键作用。因此，对抗TGF-β的生物学作用在减少瘢痕形成及防止组织纤维化中有着极其重要的意义。对抗TGF-β的现有策略主要包括:(I)干预配体TGF-β的表达水平及活性；(2)利用受体拮抗剂阻断TGF-β与其II型受体Ti3R II的结合，阻止TGF-β信号传入细胞；(3)干预TGF-β受体后信号传递途径。目前已有很多关于配体TGF-β的特异性抗体、反义寡核苷酸(ASODN)以及小分子干扰RNA (siRNA)的相关研究，大部分结果都显示可减少青光眼滤过术后的结膜瘢痕形成，但在实际应用中各有利弊。单抗对TGF-β的阻封效果较弱，在体内容易被降解且多次用药有免疫原性；AS0DN和siRNA可以减少TGF-β蛋白的生成，但是动物实验中其组织特异性和穿膜效率差，其应用还有待研究。利用受体拮抗剂阻断TGF- β与其II型受体T β R II的结合，阻止TGF- β信号传入细胞，不失为一种可以尝试的方法。本专利技术的申请人通过计算机联网检索，仅检索到2篇关于TGF-β III型受体核酸适配子的文献，并未检索到与Τβ R II相关的抗体及适配子的文献。同时，该两篇关于TGF-β III型受体核酸适配子的文献筛选Τβ RIII适配子的目的仅是用作细胞标记物，与抗瘢痕并无关系。通过配体指数级富集系统进化技术(systematicevolution of ligands by exponential enrichment, SELEX),从大容量的随机寡核苷酸库中筛选出对靶分子具有高度结合能力的寡核苷酸，这些寡核苷酸被称之为核酸适配子(aptamer,又称适配体)。适配子因其自身独特的空间构象，能够与特定的靶分子相结合，包括蛋白质、核酸、小分子有机物、金属离子等。核酸适配子由于具有高亲和力、高特异性、易体外合成等特点，已在基础研究、临床诊断与治疗以及新药研发等诸多领域展示了广阔的应用前景。因此，本专利技术的申请人应用SELEX技术，从大容量的随机寡核苷酸库中获得了高亲和力、高特异性的祀向Τβ R II的核酸适配子一Seq58,并通过作用于人Tenon’s囊成纤维细胞(HTFs)，证明了 Seq58可阻碍TGF- β与T β R II结合。但是核酸适配子普遍存在易被核酸酶降解、作用时效短等缺点。化学性修饰，例如硫代修饰能够增强核酸的稳定性，但同时增强了其细胞毒性及非特异效应。因此，选择一种有效且安全的方法来保持核酸适配子的生物活性，显得很有必要。壳聚糖(chitosan)作为一种天然的可生物降解的线性聚合物，来源丰富，理化性质相对稳定，因为其良好的生物降解性、生物相容性、较低的免疫原性，以及突出的大分子粘附能 力，近年被广泛应用于大分子、核酸、蛋白质的载体研究中。已有研究发现壳聚糖纳米化后作为寡核苷酸的载体，可有效保护寡核苷酸免于被核酸酶所降解。因此，将壳聚糖纳米微粒作为核酸适配子Seq58的载体，有望成为保持并延长Seq58生物活性的一种理想手段。
技术实现思路
针对上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种针对转化生子因子β II型受体的核酸适配子纳米制剂，即核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)_NP，并通过实验初步评价所述核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)_NP对抗血清核酸酶及缓释适配子的能力、与细胞结合的情况以及其生物活性。本专利技术的再一目的是提供所述核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP的制备方法。本专利技术的还一目的是提供所述核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP的用途。为实现上述目的，本专利技术采取如下措施:本专利技术所述针对转化生子因子β II型受体的核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP为由壳聚糖和核酸适配子组成的球形微粒，壳聚糖包裹核酸适配子，其中壳聚糖与核酸适配子的摩尔比大于20: I ;所述核酸适配子纳米制剂的粒径为100 300nm，电位为+4 +28mV ;所述核酸适配子为Seq58。优选地，本专利技术所述核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)_NP中壳聚糖与核酸适配子的摩尔比为20 30: I。优选地，本专利技术所述核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)_NP中壳聚糖的平均分子量为100000 200000，脱乙酰度>90%。本专利技术所述核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)_NP的制备方法，包括如下步骤:(I)核酸适配子的制备将核酸适配子Seq58充分溶解于TE缓冲液中，得lnmol/μ I的核酸适配子溶液，-20°C冷藏备用；(2)壳聚糖溶液的制备精密称取平均分子量为100000 200000，脱乙酰度>90%的壳聚糖溶于2%醋酸中，其中醋酸用量按照壳聚糖质量:醋酸体积=Ig: 200 300mL计算,用0.lmol/L的NaOH溶液调节PH值至5 6，加入双蒸水至壳聚糖的浓度为1.5 2.0mg/ml，用0.22 μ m —次性针头式滤器过滤后，置于无菌小瓶中，4°C冷藏备用，得壳聚糖溶液；(3)核酸适配子纳米制剂CS(Seq58)-NP的制备将步骤(I)制备的lnmol/μ I核酸适配子溶液加入到1.0 1.5ml三聚磷酸钠溶液中，所述三聚磷酸钠溶液中三聚磷酸钠的浓度为0.9mg/ml，得混合液；用5号针头将该混合液逐滴滴入到2.0 3.5ml步骤(2)制备的壳聚糖溶液中，其中壳聚糖与核酸适配子的摩尔比大于20: 1，滴加速度为40 50滴/min，至溶液出现白色乳光，再向本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种针对转化生子因子βⅡ型受体的核酸适配子纳米制剂，其特征在于：所述核酸适配子纳米制剂为由壳聚糖和核酸适配子组成的球形微粒，壳聚糖包裹核酸适配子，其中壳聚糖与核酸适配子的摩尔比大于20∶1；所述核酸适配子纳米制剂的粒径为100～300nm，电位为+4～+28mV；所述核酸适配子为Seq58。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：谢琳，陈侠，李磊，朱晓燕，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第三附属医院，
类型：发明
国别省市：
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