本发明专利技术公开了eIF3a突变基因及其扩增引物、试剂盒、扩增方法、pcβa-eIF3a-Arg803Lys突变型质粒和该质粒的制备方法。我们前期的研究中测序筛查到新的SNPs:eIF3a2554G>A，它位于10号染色体外显子（Arg803Lys），导致有义突变。前期的研究表明，eIF3a可以调控某些细胞周期和增殖分化相关基因的表达。我们试图探讨eIF3a2554G>A基因突变是否通过调控eIF3a的表达而影响其下游基因的表达。本发明专利技术成功构建了eIF3a2554G>A突变型eIF3a真核表达载体pcβa-eIF3a-Arg803Lys，有利于对eIF3a2554G>A基因功能的研究。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医学分子生物学领域，具体涉及eIF3a突变基因及其扩增引物、试剂盒、扩增方法、pc β a-eIF3a-Arg803Lys突变型质粒和该质粒的制备方法。
技术介绍
真核生物翻译调控主要发生在起始阶段，也是翻译的限速阶段。这一过程有10个以上的翻译起始因子(eukaryotic initiation factors, eIFs)参与。eIF3是翻译起始因子中最大，最复杂的一个，它由13个亚基组成，分别命名为eIF3a到eIF3m，它参与翻译起始的所有步骤。首先，参与80S核糖体解离，eIF3可以与40S核糖体亚基结合并形成复合物，从而使其保持解离状态不与60S亚基聚合。第二，eIF3参与了 43S翻译起始前复合物的形成，它与40S亚基结合后，协助招募GTP-eIF2-tRNA-methionine三聚复合物。第三，eIF3帮助mRNA与43S翻译起始前复合物结合。此外,它也参与了翻译起始复合物对起始密码子的识别和通过与内部核糖体进入位点(Internal Ribosome Entry Site, IRES)结合参与帽状结构非依赖性翻译起始 过程。eIF3a是eIF3最大的亚基，我们前期的研究表明它可以调控一些蛋白的合成，包括a-tubulin、核苷酸还原酶M2 (Ribonucleotide ReductaseM2, RRM2)和p27等。我们已有的研究证明了 eIF3a可以调控一些NER途径的蛋白翻译。我们前期的研究中测序筛查到新的SNPs:eIF3a2554G>A，它位于10号染色体外显子(Arg803Lys)，导致了有义突变。我们在前期的研究表明，eIF3a可以调控某些细胞周期和增殖分化相关基因的表达。我们试图探讨eIF3a2554G>A基因突变是否能通过调控eIF3a的表达而影响其下游基因的表达。因此需要构建eIF3a2554G>A突变型eIF3a真核表达载体。
技术实现思路
本专利技术旨在克服现有技术的不足，提供eIF3a突变基因及其扩增引物、试剂盒、扩增方法、pc β a-eIF3a-Arg803Lys突变型质粒和该质粒的制备方法。为了达到上述目的，本专利技术提供的技术方案为:一种eIF3突变基因，其基因序列如SEQ ID N0.1所示。—种检测上述突变基因的试剂盒，所述试剂盒包括如下引物:前引物:5’-AGATTTATTCGTAATGCGACT-3’ (SEQ ID N0.2)；后引物:5，-AGTTTCCCCTGTCTTCATCG-3’(SEQID N0.3)。试剂盒中其他试剂为常规PCR扩增试剂，测序试剂。一种扩增上述突变基因的方法:从质粒pci3a_eIF3a的全长cDNA上扩增出突变基因并测序，pc β a_eIF3a基因序列如SEQ ID N0.7所示；扩增体系为:5XPrimer starBuffer20 μ L, dNTP mix8 μ L，前引物 2 μ L，后引物 2 μ L，cDNA2 μ L, Primer STARl μ L,加ddH2065 y L至终体积100 μ L ;扩增条件为:95°C预变性5min，98°C 10s，58°C退火15s，72°C 2min共30个循环，72°C总延伸IOmin ;所述前引物和后引物分别如SEQ ID N0.2和SEQID N0.3 所示。一种pC0 a-eIF3a_Arg438Cys突变型质粒，所述质粒包括eIF3突变基因，所述质粒的核酸序列如SEQ ID N0.4所示。一种制备pc β a-eIF3a-Arg803Lys突变型质粒的方法,包括如下步骤:(I)从质粒pc β a-eIF3a的全长cDNA上扩增出含2554G>A位点的DNA片段Arg803Lys, pc β a_eIF3a基因序列如SEQ ID N0.7所示；扩增引物为:前引物:5’-AGATTTATTCGTAATGCGACT-3’ (SEQ ID N0.2)；后引物:5’-AGTTTCCCCTGTCTTCATCG-3’ (SEQ ID N0.3)；扩增体系为:5XPrimerstar Buffer20 μ L, dNTP mix8 μ L，前引物 2 μ L，后引物2 μ L，CDNA2 μ L, Primer STARl μ L,加 ddH2065 μ L 至终体积 100 μ L ;扩增条件为:95°C预变性 5min，98°C 10s， 58°C退火 15s，72°C 2min 共 30 个循环，72°C总延伸 IOmin ；(2)将步骤(I)的扩增的Arg803Lys用乙醇沉淀,然后在Arg803Lys末端加A尾；(3)采用切胶法回收经步骤(2)处理的Arg803Lys ；(4)将Arg803Lys与pGEM_T easy载体连接后转化至DH5 α高效率感受态细胞，于LB/氨苄平板上37°C过夜培养，再挑单克隆培养后提取质粒，然后用ApaI酶切验证连接质粒;(5)定点诱变构建pGEM-T easy_Arg803Lys突变型载体:PCR 扩增体系:10*reaction buffer5 μ L, pGEM-T easy-Arg803LysI μ g,前引物5，-GGCAGCGTAAAGAAGAACGCAAGATAACATACTATAGAGAAA-3，( SEQ ID N0.5)I μ L，后引物 5’ -TTTTCTCTATAGTATGTTATCTTGCGTTCTTCTTTACGCTGCC-3’ (SEQ ID N0.6) I μ L，dNTP mixlμ L，Quik Solution reagentl.5 μ L, ddH20 力口至 50 μ L,最后力口 I μ L Quik change Enzyme ；热循环:96°C2min,96°C 20s,60°C 10s,68°C 2min 共 20 个循环。最后 68°C延伸5min ；将PCR产物经Dpn I消化后转化至XLlO-Gold超级感受态细胞，涂布LB/氨苄平板，37°C下培养后挑单克隆培养，提取质粒，即为pGEM-T easy-Arg803Lys突变型载体；(6)分别将 pGEM-T easy_Arg803Lys 突变型载体和 pc β a_eIF3a 进行 MluI和BspDI双酶切，将pc β a-eIF3a双酶切后不含2554G>A位点的DNA片段与pGEM_Teasy-Arg438Cys酶切后含2554G>A位点的DNA片段进行连接，然后将连接产物用BL21感受态细胞进行转化，涂LB/氨苄平板筛选，挑单克隆LB培养基培养并提取质粒，即得pc β a-eIF3a-Arg803Lys 突变型质粒。本专利技术采用pc β a空载体成功构建了 eIF3a2554G>A突变型eIF3a真核表达载体。附图说明图1为含2554G>A位点的DNA片段的PCR扩增产物图，泳道I和2均为PCR扩增片段；图2为pGEM-T easy与Arg803Lys片段连接后ApaI单酶切验证图；图3为pGEM-T easy-Arg803Lys定点诱变后测序结果与原pGEM_Teasy_Arg803Lys序列比较图4 为 pGEM-T easy_Arg本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种eIF3突变基因，其特征在于，所述基因序列如SEQ?ID?NO.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘昭前，王瑛，郭成贤，尹继业，陈娟，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：
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