按照本发明专利技术的使用利用共焦显微镜或多光子显微镜进行光计量的扫描分子计数法对来自发光粒子的光进行检测并分析的技术的特征在于，一边通过变更显微镜的光学系统的光路来使光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内移动，一边检测来自光检测区域的光的多个波长频带的成分的强度，在检测出的光的多个波长频带的成分的强度中个别地检测来自各个发光粒子的光的信号，根据检测出的发光粒子的光的信号的多个波长频带的成分的强度来识别发光粒子的种类。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种光分析装置和方法，能够使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等可检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统检测来自分散或溶解在溶液中的原子、分子或它们的聚合体(以下将它们称为“粒子”)、例如蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞等粒子状的对象物、或非生物学粒子的光，来获取在分析或解析它们的状态(相互作用、结合/离解状态等)时有用的信息，更详细地说，涉及一种能够使用如上所述的光学系统个别检测来自单个发光的粒子的光并进行各种光分析的装置和方法。此外，在本说明书中，发出光的粒子(以下称为“发光粒子”)可以是其自身发出光的粒子以及附加了任意的发光标识或发光探针的粒子中的任意一个，从发光粒子发出的光可以是荧光、磷光、化学发光、生物发光等。
技术介绍
由于近年来的光计量技术的发展，使用共焦显微镜的光学系统和还能够进行光子计数(单光子检测)的超高灵敏度的光检测技术，能够检测/测量单光子或荧光单分子水平的微弱光。因此，提出了各种使用这样的微弱光的计量技术对生物体分子等的特性、分子间相互作用或结合/离解反应进行检测的装置或方法。例如，在荧光相关光谱分析(Fluorescence Corr elation Spectroscopy:FCS。例如参照专利文献 1-3、非专利文献 1-3)中，利用激光共焦显微镜的光学系统和光子计数技术，测量来自出入样本溶液中的微小区域(被称为显微镜的激光会聚到的焦点区域-共焦区组织)内的荧光分子或被进行了荧光标识的分子(荧光分子等)的荧光强度，根据由进行该测量得到的荧光强度的自相关函数的值所确定的荧光分子等在微小区域内的平均滞留时间(平移扩散时间)和滞留的分子的个数的平均值，来获取荧光分子等的运动的速度或大小、浓度之类的信息，或检测分子的构造或大小的变化、分子的结合/离解反应或分散/聚合之类的各种现象。另外，在荧光强度分布分析(Fluorescence-1ntensity Distribution Analysis:FIDA。例如专利文献 4、非专利文献4)、光子计数直方图(Photon Counting Histogram:PCH。例如专利文献5)中，生成与FCS同样地计量出的出入共焦区组织内的荧光分子等的荧光强度的直方图，使统计性的模型公式拟合该直方图的分布，由此估算荧光分子等的固有的亮度的平均值和滞留在共焦区组织内的分子的个数的平均值，根据这些信息估计分子的构造或大小的变化、结合/离解状态、分散/聚合状态等。另外，除此以外，在专利文献6、7中，提出了根据利用共焦显微镜的光学系统计量出的样本溶液的荧光信号的时间经过来检测荧光性物质的方法。专利文献8提出了一种信号运算处理技术，其用于使用光子计数技术计量来自流通于流式细胞仪的荧光微粒子或固定在基板上的荧光微粒子的微弱光，来检测流体中或基板上的荧光微粒子的存在。特别是，根据FCS、FIDA等使用了利用共焦显微镜的光学系统和光子计数技术的微小区域的荧光测量技术的方法，进行测量所需要的样本与以前相比可以是极低浓度且极微量(在一次测量中使用的量至多为几十uL左右)，测量时间也大幅缩短(在一次测量中多次反复进行秒级时间的计量)。因而，期待这些技术特别是在对医学、生物学的研究开发领域中经常使用的稀少或昂贵的样本进行分析的情况下，或在疾病的临床诊断、生理活性物质的筛选等检体数多的情况下，成为与以前的生物化学方法相比能够廉价或迅速地执行实验或检查的强力工具。专利文献1:日本特开2005-098876专利文献2:日本特开2008-292371专利文献3:日本特开2009-281831专利文献4:专利第4023523号专利文献5:国际公开2008-080417专利文献6:日本特开2007-20565专利文献7:日本特开2008-116440专利文献8:日本特开平4-337446号公报非专利文献1:金城政孝、蛋白质核酸酶Vol.44、N0.9、1431-1438页1999年非专利文献2:F.J.Meyer-Alms> 突光相关谱(Fluorescence CorrelationSpectroscopy)、R.Rigler 编、Springer、柏林、2000 年、204-224 页非专利文献3:加藤则子及其他4名、遗传医学、Vol.6、N0.2,271-277页非专利文献4:卡斯柯(Kask)及`其他3名、美国科学学院纪要、1999年、96卷、13756-13761 页(P.Kask, K.Palo, D.Ullmann, K.Gall PNAS96, 13756-13761(1999))
技术实现思路
专利技术要解决的问题在上述的FCS、FIDA等使用了共焦显微镜的光学系统和光子计数技术的光学分析技术中，所计量的光是从荧光单分子或多分子发出的光，但在该光的解析中，执行按时间序列测量出的荧光强度数据的自相关函数的运算或对直方图拟合之类的荧光强度的波动的计算等统计性的处理，并非个别地参照或分析来自各个荧光分子等的光的信号。即，在这些光分析技术中，对来自多个荧光分子等的光的信号统计性地进行处理，针对荧光分子等检测统计平均性的特性。因而，为了在这些光分析技术中得到统计上有意义的结果，样本溶液中的作为观测对象的荧光分子等的浓度或数密度需要是在平衡状态下在一次秒级长度的计量时间内能够进行统计性处理的个数的荧光分子等出入微小区域内的水平，优选的是在微小区域内始终存在一个左右的荧光分子等的水平。实际上，共焦区组织的体积为IfL左右，因此，在上述的光分析技术中使用的样本溶液中的荧光分子等的浓度典型地是InM左右或其以上，在大幅低于InM时，产生在共焦区组织内不存在荧光分子等的时间而无法得到统计上有意义的分析结果。另一方面，在专利文献6 8所记载的荧光分子等的检测方法中，不包括荧光强度的波动的统计性的运算处理，即使样本溶液中的荧光分子等小于InM也能够对荧光分子等进行检测，但无法达成定量地计算出在溶液中随机运动的荧光分子等的浓度或数密度之类的内容。因此，本申请的申请人在日本特愿2010-044714和PCT/JP2011/53481中，提出了基于以下的新原理的光分析技术，即能够定量地观测作为观测对象的发光粒子的浓度或数密度低于利用FCS、FIDA等包含统计性处理的光分析技术进行处理的水平的样本溶液中的发光粒子的状态或特性。在所述新的光分析技术中，如果清楚地进行描述，则与FCS、FIDA等同样地，在使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统的情况下，一边使作为光的检测区域的微小区域(以下称为“光检测区域”)的位置在样本溶液内移动、即一边通过光检测区域对样本溶液内进行扫描，一边在光检测区域中包含在样本溶液中分散且随机地运动的发光粒子时检测从该发光粒子发出的光，由此，能够对样本溶液中的发光粒子逐个地进行个别检测，来获取与发光粒子的计数、样本溶液中的发光粒子的浓度或数密度有关的信息。根据该新的光分析技术(以下称为“扫描分子计数法”)，与FCS、FIDA等光分析技术同样地，进行测量所需的样本可以是微量的(例如几十μ L左右)，另外，测量时间短，并且与FCS、FIDA等光分析技术的情况相比，能本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：叶梨拓哉，田边哲也，山口光城，
申请(专利权)人：奥林巴斯株式会社，
类型：
国别省市：
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