组合物、抗体、哮喘诊断方法和制备抗体的方法技术

本发明专利技术提供了用于制备抗体的方法，该方法包括将3-溴-4-羟基-苯甲酸掺入蛋白质中，以形成抗原，用该抗原免疫哺乳动物宿主，和从宿主收集对抗原具有亲和性的抗体。提供了对单卤代酪氨酸具有结合亲和性的抗体，以及包含与单卤代酪氨酸结合的抗体的组合物。还提供了包含具有3-溴-4-羟基-苯甲酸部分的蛋白质的组合物。提供了用于评价哮喘严重性的方法，该方法包括使用对单卤代酪氨酸具有结合亲和性的抗体分析病人的痰，并测量与蛋白质结合的抗体的量。还提供了测定体液中嗜伊红粒细胞活性的方法，该方法包括将体液暴露于对单卤代酪氨酸具有结合亲和性的抗体，并测量结合的抗体的量，以确定嗜伊红粒细胞活性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术的公开内容涉及抗体的制备及其用途。公开内容的特定实施方案涉及对单卤代酪氨酸具有亲和性的抗体的制备和具有单卤代酪氨酸部分的蛋白质。背景哮喘是一种特征在于气道短暂变窄的常见病。其是影响了美国约23百万成人的主要公众健康问题。认为激活的嗜伊红粒细胞浸润至支气管中是哮喘的主要诱因。痰和肺活体样本中的嗜伊红粒细胞计数和分泌的嗜伊红粒细胞颗粒蛋白(如，嗜伊红粒细胞过氧化物酶(EPO))的存在表示哮喘的严重性。在哮喘病人中由于ΕΡ0，溴酪氨酸蛋白质修饰增加，EPO催化次溴酸盐的形 成，以及随后溴酪氨酸的形成。之前使用气相色谱和质谱检测的研究发现了在来自哮喘患者的支气管肺泡灌洗流体和痰样本中，3-溴酪氨酸和3，5- 二溴酪氨酸各自显著升高。对溴化蛋白质在哮喘中的作用的研究受限于缺乏快速、简单的方法来监控生物流体中的溴酪氨酸水平。公开内容概述如下将列出本专利技术的其他优点和新的特征，并且从在此所列的描述和证明是显而易见的。因此，本专利技术公开内容的以下描述应当看作是公开内容的说明而不是以任何方式限制。溴酪氨酸修饰的蛋白质可以用作用于气道氧化应激的稳定的生物标记。据信3-溴酪氨酸是体内产生的主要溴酪氨酸；然而，之前的尝试不能产生识别3-溴酪氨酸的有用抗体。例如,在1930年，Wormall报道了产生对抗3，5- 二溴酪氨酸的兔抗血清，但他的尝试未能产生3-溴酪氨酸抗体。更近一些,Kambayashi等和Kato等产生了针对溴化蛋白质的多克隆和单克隆抗体，但他们的抗体还是只能与3，5- 二溴酪氨酸反应。这些产生识别3-溴酪氨酸的抗体的失败可能源于用于产生抗原的条件。质谱和核磁共振分析表明作为体外蛋白质溴化的结果，相对于3-溴酪氨酸修饰，优先产生二溴酪氨酸修饰。当使用预期模拟体内溴化的试剂时，可能难以产生良好的用于3-溴酪氨酸的抗原。本专利技术公开内容描述了提供可以包括具有3-溴-4-羟基-苯甲酸部分的蛋白质的抗原组合物。本专利技术公开内容还提供了生产这种抗原的方法。从这种抗原，可以鉴定出不仅显示出识别单溴化的酪氨酸残基并且还结合其他卤化的酪氨酸残基的对卤代酪氨酸具有亲和性的抗体。提供了生产这些对这种抗原以及卤代酪氨酸(包括单卤代酪氨酸)具有亲和性的抗体的方法。提供了对具有卤代酪氨酸部分的蛋白质具有亲和性的抗体以及包括结合卤代酪氨酸的抗体的组合物。此外，公开内容证明了所公开的抗体能够区分来自健康对照和哮喘患者之间的人痰蛋白质中的卤代酪氨酸水平。提供了评价哮喘严重性的方法以及确定嗜伊红粒细胞计数的方法。附图简述以下将参照以下的附图来描述公开内容的实施方案。附图说明图1是用于生产根据公开内容的实施方案的抗原的合成图解。图2是根据公开内容的实施方案生产的抗体的试验描绘。图3是利用根据公开内容的实施方案生产的抗体获取的数据的描绘。图4是蛋白质的描绘部分，和利用根据公开内容的实施方案生产的抗体获取的数据。图5是利用根据公开内容的实施方案生产的抗体获取的数据的描述。描述在此将描述本专利技术的各种优点和新的特征，并且对本领域技术人员而言从以下的详细描述将变得显而易见。 在之前和之后的描述中，通过说明和描述来提供公开内容的实施方案。如将会认识到的，公开内容能够在各个方面有所改变而没有脱离公开内容。因此，下文中所列的附图和实施方案的描述应视为本质上是说明性的，而不是作为限制。本专利技术的公开内容提供了组合物、抗体、抗原、生产抗原的方法、生产抗体的方法和评价哮喘的方法，以及确定嗜伊红粒细胞计数的方法。提供了制备抗体的方法。该方法可以包括将卤代酪氨酸类似物(如3-溴-4-羟基-苯甲酸)掺入蛋白质中，以形成抗原。该方法可以进一步包括用该抗原免疫哺乳动物宿主，并且从宿主收集对抗原具有亲和性的抗体。根据实施例实施，该蛋白质可以是钥孔血蓝蛋白(KLH)。根据这种方法，组合物包括通过用模拟3-溴酪氨酸的化合物修饰KLH提供的抗原。因此，提供了一种包括具有3-溴-4-羟基-苯甲酸部分的蛋白质的组合物，例如，该蛋白质是KLH。根据该公开内容的各个方面，这可以避免与体外蛋白质溴化和主要生产二溴酪氨酸相关的问题。然后可以在优化单溴化的条件下溴化牛血清白蛋白(BSA)，并且随后用于筛选杂交瘤细胞系和鉴定可能对生理上相关的酪氨酸修饰具有亲和性的克隆。这种所得到的BTK-94C抗体对3-溴酪氨酸和3，5- 二溴酪氨酸具有亲和性，对3-氯酪氨酸和3，5- 二氯酪氨酸也具有亲和性，但对未修饰的酪氨酸、3-硝基酪氨酸或3-羟基酪氨酸不具有亲和性(参见，例如，图2和4)。还提供了使用次氯酸盐的蛋白质的氯酪氨酸修饰，次氯酸盐是髓过氧化物酶的产物，髓过氧化物酶是在嗜中性粒细胞和巨噬细胞中发现的一种酶。因为这种抗体看来似乎结合所有四种生理上相关的卤化蛋白质酪氨酸残基，因此BTK-94C可以认为是一种通用卤代酪氨酸抗体。因此，该公开内容的方法提供了一种对蛋白质卤代酪氨酸(并且在特定的实施方案中，单卤代酪氨酸)具有结合亲和性的抗体。卤代酪氨酸可以是单卤代酪氨酸和/或二卤代酪氨酸之一或两者。单齒代酪氨酸可以是溴酪氨酸和/或氯酪氨酸之一或两者。单卤代酪氨酸也可以是3-溴酪氨酸和/或3-氯酪氨酸之一或两者。二卤代酪氨酸也可以是3，5- 二溴酪氨酸和/或3，5- 二氯酪氨酸之一或两者。还提供了包括与抗原结合的本专利技术公开内容的抗体的组合物，所述抗原是卤代酪氨酸和/或卤代酪氨酸蛋白质。使用本专利技术公开内容的抗体的实施例实施可以克服与之前所用方法相关的各种问题。尽管已经存在几种报道了与溴化蛋白质反应的多克隆和单克隆抗体，但那些抗体看来似乎只与二溴酪氨酸反应，而不与3-溴酪氨酸反应。因为3-溴酪氨酸是体内观察到的主要修饰，因此这是重要的限制。本专利技术公开内容进一步提供了可以包括将抗体暴露于体液以确定例如，一种或多种嗜伊红粒细胞活性、炎症和/或具有单卤代酪氨酸和/或二卤代酪氨酸部分的蛋白质的量的方法。还提供了评价哮喘严重性的方法。该方法可以包括使用对单卤代酪氨酸具有结合亲和性的抗体分析病人的痰，并且测量结合蛋白质的抗体的量。该方法可以是定性和/或定量中的一种或两种。该方法可以包括关联结合抗体的量，以确定炎症的量。该方法可以分开或一起包括使用结合抗体的量来监控对哮喘发作的药物反应。还提供了确定体液中嗜伊红粒细胞活性的方法。该方法可以包括将体液暴露于对单卤代酪氨酸具有结合亲和性的抗体，并且测量结合抗体的量来确定嗜伊红粒细胞活性。体液可以是例如痰或灌洗流体。该方法还可以包括关联结合抗体的量，例如以确定炎症和/或药物反应。因此，用从哮喘患者和健康对照收集的人痰样品测试了 BTK-94C。ELISA微矩阵分析证明了人痰样品中的4种蛋白质在哮喘患者中的卤化水平提高。这些数据表明溴化是嗜伊红粒细胞活性的特异性指示 并且这4种特异性蛋白质响应哮喘相关的嗜伊红粒细胞活性而得到修饰。此外，这些蛋白质的卤化水平在监控哮喘中是有用的。以下描述了一种新的单克隆抗体(BTK-94C)，其识别溴化和氯化蛋白质。这些卤代酪氨酸蛋白质修饰是炎性细胞活性的表示。将这种抗体用作夹层ELISA中的检测试剂来证明四种痰蛋白质的卤代酪氨酸水平在哮喘患者中是升高的。因此，BTK-94C抗体可以提供哮喘患者中炎症的指示，并且这些ELISA可以证明对于本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：H·金，R·C·赞伽，
申请(专利权)人：巴特勒纪念研究院，
类型：
国别省市：