本发明专利技术涉及一种研究家蚕蛋白抗细胞凋亡的方法，该方法利用家蚕杆状病毒体外表达系统表达并纯化目的蛋白，通过自建的过氧化氢诱导的家蚕细胞凋亡模型，进而研究目的蛋白对家蚕细胞凋亡的抑制作用。具体而言，本发明专利技术包括以下步骤：1）目的蛋白的表达和纯化；2）建立过氧化氢诱导的家蚕细胞凋亡模型：利用过氧化氢诱导家蚕细胞的凋亡，从而建立体外细胞凋亡模型；3）检测目的蛋白对家蚕细胞凋亡的抑制作用。本发明专利技术证实了杆状病毒表达系统表达的家蚕30Kc6蛋白对过氧化氢诱导的家蚕细胞的凋亡有明显的抑制作用，同时也证明了30Kc6蛋白能有效抑制H2O2诱导的BmN细胞中细胞色素c从线粒体向细胞质中的释放。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种研究家蚕蛋白抗细胞凋亡的方法，该方法利用家蚕杆状病毒体外表达系统表达并纯化目的蛋白，通过自建的过氧化氢诱导的家蚕细胞凋亡模型，进而研究目的蛋白对家蚕细胞凋亡的抑制作用。
技术介绍
目前，对酵母和哺乳动物细胞凋亡的研究越来越多，这些研究成果虽然促进了对昆虫细胞凋亡的研究，但昆虫细胞与酵母和哺乳动物细胞不同，在诱导细胞凋亡的因子、诱导方法和细胞凋亡的检测方面都有很多的不同之处，如病毒感染、紫外线辐射、蛋白质合成抑制剂、脂类信号小分子、重金属离子和植物源农药等都可以诱导昆虫细胞的凋亡，但诱导的条件和检测方法均有很大的差异。同时，昆虫细胞内既有类似于线虫的凋亡信号通路，也有类似于哺乳动物细胞的凋亡信号通路。这些都表明昆虫细胞的凋亡与其他动物细胞存在着一些差异。随着家蚕基因组框架图的完成，关于家蚕细胞凋亡机制的探索已成为研究热点之一，建立适应于昆虫细胞的凋亡诱导条件和检测的方法将具有重要意义。目前有关家蚕细胞凋亡的研究工作主要集中在对家蚕血淋巴对细胞凋亡的抑制作用，研究结果表明家蚕血淋巴能抑制由多种化学物质，如放线菌素D、喜树碱和星形孢菌素和丁酸钠诱导的细胞凋亡。大量的研究结果已证实家蚕血淋巴中对昆虫细胞和多种哺乳动物细胞具有凋亡抑制作用的成份即为家蚕30K蛋白。家蚕30K蛋白是家蚕生长发育过程中的主要存储蛋白之一，兼具载脂功能。家蚕30Kc6蛋白为该蛋白家族成员，有研究结果表明该蛋白具有一定抗昆虫细胞凋亡的功能，但由于缺乏适当的昆虫细胞凋亡模型，有关其抗凋亡的作用机制还鲜见报道
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种检测目的蛋白对抗过氧化氢诱导的家蚕细胞凋亡是否具有抑制作用的方法。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种，包括以下步骤:I)、目的蛋白的表达和纯化；2)、建立过氧化氢诱导的家蚕细胞凋亡模型:利用过氧化氢诱导家蚕细胞的凋亡，从而建立体外细胞凋亡模型；3)、检测目的蛋白对家蚕细胞凋亡的抑制作用。作为本专利技术的的改进:家蚕细胞凋亡模型的建立方法为:将处于对数生长期的半贴壁家蚕培养细胞BmN按3X IO3个/孔接种到96孔培养板，加入细胞全培养基后在细胞培养箱中于26 28°C (例如为27°C)培养至细胞铺满孔底(培养时间约为24h),弃去细胞全培养基后；用Hanks液洗,再分别加入100 μ mol/L、lmmol/L、5mmol/L和lOmmol/L H2O2梯度处理2h、4h和6h，然后用Hanks液洗后，再分别加入细胞全培养基，继续于26 28。。(例如为27°C)培养22 26h (例如为24h)；细胞全培养基为Sf-900:FBS=9: I的体积比。作为本专利技术的的进一步改进:家蚕细胞凋亡模型的建立方法中，BmN细胞的最佳处理条件为:5mmol/L H2O2处理细胞，27°C培养4h。 作为本专利技术的的改进:步骤3)为通过ELISA法检测目的蛋白对家蚕细胞凋亡的抑制作用。作为本专利技术的的进一步改进:步骤3)为:将处于对数生长期的家蚕细胞BmN，按3X IO3个/孔接种到96孔培养板中，加入细胞全培养基后在细胞培养箱中于26 28°C (例如为27°C)培养至细胞铺满孔底(培养时间约为24h);再加入纯化的目的蛋白至目的蛋白终浓度为4飞μ g/ml，对细胞进行预处理；继续于26 28°C (例如为27°C)培养22 26h (例如为24h)后，用Hanks液洗，再加入5mmol/LH2O2于26 28°C (例如为27°C )处理3.5 4.5h (例如为4h)，接着用Hanks液洗，再加入含有浓度为5 μ g/ml目的蛋白的无血清细胞培养基，于26 28°C (例如为27°C)培养22 26h(例如为24h)；然后分别检测细胞的活力、检测细胞的凋亡情况、检测细胞内8-1soprostane的浓度；无血清细胞培养基为Sf-900。备注说明:当目的蛋白处理组(细胞活力、8-1soprostane的浓度、DNA片段化)与过氧化氢处理组相比有显著差异时，证明目的蛋白对抗过氧化氢诱导的家蚕细胞凋亡具有抑制作用；反之，当目的蛋白处理组(细胞活力、8-1soprostane的浓度、DNA片段化)与过氧化氢处理组相比没有显著差异时，证明目的蛋白对抗过氧化氢诱导的家蚕细胞凋亡不具有抑制作用。作为本专利技术的的进一步改进:利用Cell Proliferation ELISA试剂盒(Roche)检测细胞的活力、Cell DeathDetection ELISA (Roche)试剂盒检测细胞的凋亡情况、8-1soprostane EIA kit检测细胞内 8-1soprostane 的浓度。作为本专利技术的的进一步改进:利用蛋白免疫印迹法检测细胞色素c的释放。作为本专利技术的的进一步改进:利用蛋白免疫印迹法检测细胞色素c的释放包括以下步骤:将处于对数生长期的家蚕细胞BmN按I X IO6个/皿接种于培养皿(60mm的直径)中，加入细胞全培养基后在细胞培养箱中于26 28°C (例如为27°C)培养至细胞铺满平皿(培养时间约为12h);加入纯化的目的蛋白样品至目的蛋白终浓度为5 μ g/ml，对细胞进行预处理；继续于26 28°C (例如为27°C )培养22 26h (例如为24h)后，用Hanks液洗，加入5mmol/L H2O2于26 28。。(例如为27°C)处理3.5 4.5h (例如为4h)，接着用Hanks液洗，再加入含有浓度为5 μ g/ml的目的蛋白的无血清细胞培养基，于26 28°C (例如为27°C )继续培养22 26h(例如为24h);收集细胞，细胞用预冷的PBS清洗，加入裂解液(150 250 μ I);用细胞刮刮下细胞，收集细胞裂解液(即裂解所得物)于离心管中离心，取上清，进行SDS-PAGE电泳，随后转移到PVDF膜；将膜置于含5%的脱脂奶粉的TBST缓冲液(S卩，每L的TBST缓冲液含有50g脱脂奶粉)的中封闭过夜，然后在含0.1% (体积比)Tween-20的TBST缓冲液与纯化鼠抗细胞色素c单克隆抗体4°C孵育过夜(12h);清洗后，用辣根过氧化物酶标记的二抗杂交，进行化学发光显色。备注说明:当PVDF膜上目的蛋白处理组的线粒体条带比过氧化氢处理组的线粒体条带更亮，而目的蛋白处理组的细胞质的条带比过氧化氢的条带比过氧组的细胞质条带更暗，表明目的蛋白能够抑制过氧化氢诱导的细胞色素C从线粒体释放进入细胞质，证明目的蛋白对过氧化氢诱导的家蚕细胞凋亡具有抑制作用；反之，目的蛋白处理组的细胞质以及线粒体的条带明暗与过氧化氢处理组没有明显差异时，证明目的蛋白不能抑制过氧化氢诱导的细胞色素C从线粒体释放进入细胞质。作为本专利技术的的进一步改进:目的蛋白包括家蚕30Kc6蛋白、家蚕30K蛋白Sip、家蚕30K蛋白Lsp_t。在本专利技术中，在96孔培养板的孔内加入各种培养基(或H2O2)等的量为15(T200ul。本专利技术利用自建的过氧化氢诱导的家蚕细胞凋亡模型来研究家蚕30Kc6蛋白抗细胞凋亡的研究方法:利用过氧化氢诱导家蚕细胞的凋亡，建立体外细胞凋亡模型，通过ELISA法检测家蚕30Kc6蛋对昆虫细胞凋亡的抑制作用。在本专利技术中，当目的蛋白处理组的细胞活力、DNA片段化以及细胞内8-1so本文档来自技高网...
【技术保护点】
检测目的蛋白对昆虫细胞是否具有凋亡抑制作用的方法，其特征是包括以下步骤：1）、目的蛋白的表达和纯化；2）、建立过氧化氢诱导的家蚕细胞凋亡模型：利用过氧化氢诱导家蚕细胞的凋亡，从而建立体外细胞凋亡模型；3）、检测目的蛋白对家蚕细胞凋亡的抑制作用。
【技术特征摘要】
1.检测目的蛋白对昆虫细胞是否具有凋亡抑制作用的方法，其特征是包括以下步骤: 1)、目的蛋白的表达和纯化； 2)、建立过氧化氢诱导的家蚕细胞凋亡模型: 利用过氧化氢诱导家蚕细胞的凋亡，从而建立体外细胞凋亡模型； 3)、检测目的蛋白对家蚕细胞凋亡的抑制作用。2.根据权利要求1所述的检测目的蛋白对昆虫细胞是否具有凋亡抑制作用的方法，其特征是:家蚕细胞凋亡模型的建立方法为: 将处于对数生长期的半贴壁家蚕培养细胞BmN按3 X IO3个/孔接种到96孔培养板，加入细胞全培养基后在细胞培养箱中于26 28°C培养至细胞铺满孔底，弃去细胞全培养基后；用 Hanks 液洗,再分别加入 100 μ mol/L、lmmol/L、5mmol/L 和 10mmol /T, H2O2 梯度处理 2h、4h和6h，然后用Hanks液洗后，再分别加入细胞全培养基，继续于26 28°C培养22 26h ； 细胞全培养基为Sf-900:FBS=9:1的体积比。3.根据权利要求2所述的检测目的蛋白对昆虫细胞是否具有凋亡抑制作用的方法，其特征是:家蚕细胞凋亡模型的建立方法中，BmN细胞的处理条件为:5mmol/L H2O2处理细胞，27°C 培养 4h。4.根据权利要求1、2或3所述的检测目的蛋白对昆虫细胞是否具有凋亡抑制作用的方法，其特征是: 所述步骤3)为通过ELISA法检测目的蛋白对家蚕细胞凋亡的抑制作用。5.根据权利要求4所述的检测目的蛋白对昆虫细胞是否具有凋亡抑制作用的方法，其特征是所述步骤3)为: 将处于对数生长期的家蚕细胞BmN，按3X IO3个/孔接种到96孔培养板中，加入细胞全培养基后在细胞培养箱中于26 28°C培养至细胞铺满孔底；再加入纯化的目的蛋白至目的蛋白终浓度为4 6μ g/ml，对细胞进行预处理；继续于26 28°C培养22 26h后，用Hanks液洗，再加入5mmol/L H2O2于26 28°C处理3.5^4.5h，接着用Hanks液洗，再加入含有浓度为5 μ g/ml目的蛋白的无血清细胞培养基，于...
【专利技术属性】
技术研发人员：于威，应慧慧，李擎，全滟平，童富淡，张耀洲，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：
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