一种β-酪蛋白位点定点整合Lys基因的打靶载体及其构建的细胞制造技术

本发明专利技术公开了一种β-酪蛋白位点定点整合Lys基因的打靶载体及其构建的细胞，包括目的基因Lys，在的基因Lys的上游和下游分别设有5’同源臂和3’同源臂，以牛β-酪蛋白位点第二内含子锌指核酸酶识别位点的上下游各延伸700～850bp的同源序列作为5’同源臂和3’同源臂。本发明专利技术使用电穿孔的方法将打靶载体pCSN2-Lys-Neo-EGFP和锌指核酸酶表达载体共转染牛胎儿成纤维细胞，经过G418药物筛选和PCR分析后获得了打靶的阳性克隆细胞，以打靶的阳性克隆细胞为核供体移入牛去核卵母细胞，获得转基因克隆胚胎，为研制抗乳房炎的转基因奶牛提供坚实的基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因克隆
，涉及一种β -酪蛋白位点定点整合Lys基因的打靶载体及其构建的细胞。
技术介绍
奶牛乳腺炎(Mastitis)是奶牛乳腺受到物理、化学刺激，尤其是细菌的侵袭而引起的一种炎症反应，造成奶牛产奶量下降，奶品质降低，增加生产成本，严重的使奶牛提早淘汰，给奶业发展造成了巨大的损失。据统计资料显示:世界上大多数国家乳腺炎的发病率平均约 40%、美国高达 48.5%、芬兰 30.6%、加拿大 19.8%、中国 30% (Gi 11 J.J etal, 2006)。尽管引起奶牛乳腺炎的病原菌有137种之多(Ranjan R etal，2006)，但是金黄色葡萄球菌是最常见的乳腺炎病原菌之一，占到发病率的15-30%，通常引起亚临床型或者慢性感染(Sutra L etal, 1994)。目前，治疗乳腺炎仍然采用抗生素治疗,尽管有效但治愈率低下，通常不足15%。这是由于金黄色葡萄球菌在感染的过程中形成荚膜，在乳腺上皮细胞和巨噬细胞里存活，从而导致对抗生素的不敏感(Almeida R.A etal, 1996; Hebert Aetal, 2000;Hensen S.M本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种Lys乳腺特异性打靶载体，其特征在于，包括目的基因Lys，在的基因Lys的上游和下游分别设有5’同源臂和3’同源臂，以牛β?酪蛋白位点第二内含子锌指核酸酶识别位点的上下游各延伸700～850bp的同源序列作为5’同源臂和3’同源臂。

【技术特征摘要】
1.一种Lys乳腺特异性打靶载体，其特征在于，包括目的基因Lys，在的基因Lys的上游和下游分别设有5’同源臂和3’同源臂，以牛酪蛋白位点第二内含子锌指核酸酶识别位点的上下游各延伸700 850bp的同源序列作为5’同源臂和3’同源臂。2.如权利要求1所述的Lys乳腺特异性打靶载体，其特征在于，所述的目的基因Lys的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.1所示，所述的5，同源臂的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.2所示，3’同源臂的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.3所示。3.如权利要求1所述的Lys乳腺特异性打靶载体，其特征在于，所述的5’同源臂的下游还连接有包括剪切拼接位点SA、多克隆位点和两个同向Loxp的序列。4.如权利要求3所述的Lys乳腺特异性打靶载体，其特征在于，所述的5’同源臂的下游连接的序列如SEQ.1D.N0.4所示。5.如权利要求3所述的Lys乳腺特异性打靶载体，其特征在于，所述的多克隆位之间还插入有SV40PolyA序列。6.如权利要求3所述的Lys乳腺特异性打靶载体，其特征在于，所述的两个同向Loxp的序列之间还依次设有以下元件=PTK启动子、抗生素筛选基因、Pol...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘旭，张涌，王勇胜，郭文江，权富生，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，杨凌科元克隆股份有限公司，
类型：发明
国别省市：