本发明专利技术属于基因序列及其获取方法领域，具体涉及导致西瓜两性花发育的基因a序列及其获得方法。导致西瓜两性花发育的基因a，具有序列表中的SEQ?ID?NO:1～6的核苷酸碱基序列，该获取方法包括以下步骤：A、供试材料选取，B、基因组DNA的提取，C、长距离PCR扩增反应与产物的检测，D、特异性扩增序列的获得，E、候选SNP的获得，F、对所述的候选SNP位点进行验证，最终获得所述的导致西瓜两性花发育的基因a序列。本发明专利技术通过F2代分离群体dCAPs分子标记检测及表型鉴定、各核心种质资源dCAPs分子标记检测及表型鉴定确认该SNP位点为共分离标记；获得的SNP位点，能够开发基因标记用于辅助育种，达到获得西瓜雌性系品种的目的。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因序列及其获取方法领域，具体涉及。
技术介绍
西瓜(Citrullus Ianatus)为葫芦科黄瓜属一年生蔓生草本植物,是一种国内外广泛栽培的重要经济作物。我国自汉代以来就有种植西瓜的历史，是世界上最早栽培西瓜的国家之一，也是目前世界上西瓜栽培面积最大、产量最高的国家。西瓜是植物性别分化机理研究的模式作物，研究西瓜性别机制有助于植物性别分化研究发展，并能提高育种效率、降低育种成本。西瓜植株的主要性型有雌雄异花同株(A-Gy-)、雄花完全花同株(雄完株,aaGy-)、雌性系(Α-gygy)和完全花系(aagygy)三种，由两个主效基因控制，分别为a基因和gy基因。其中a基因主要控制雌花中雄蕊的发育，gy基因主要控制雄花中雌蕊的发育。在这两个基因的共同作用决定了西瓜植株的性别发育模式。a基因在西瓜性别发育模式中具体相当重要的作用，它直接控制着雄蕊原基是否发育，对雌雄同株植物的性别发育模式研究至关重要。且培育雌性系品种必须保证每个节位均长出纯雌花。纯雌性系品种对于降低育种人工成本、提高种子纯度有极其重要的意义，具有很强的实用价值。故对于a基因的研究具有相当大的参考意义。比较基因组学是现代分 子生物学研究的一个重要手段，通过对同源生物的同源基因进行全基因组比对，可迅速获得候选基因。在对候选基因序列分析的基础上即可获得目标性状的差异位点并设计特异性分子标记。通过遗传分离群体验证及表型分析，即可迅速锚定目标基因，大大缩短了分子标记开发进程。因此，本项研究拟利用比较基因组学方法，利用已发表的甜瓜a基因在西瓜深度序列上进行全基因组搜索，结合遗传分离群体检测及自然群体分析结果确定导致西瓜两性花发育的基因a基因序列。但是，利用比较基因组学原理进行同源克隆的准确率一般只在50%左右。虽是获取目标基因的一种重要手段，却不能作为唯一的衡量标准。在西瓜育种的科研和实践中需要，利用同源克隆技术获取多个目标基因并对进行逐一验证，以便最终确定候选基因开展下一步工作。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的:导致西瓜两性花发育的基因a，具有序列表中的SEQ ID NO:1 6的核苷酸碱基序列。导致西瓜两性花发育的基因a，具有翻译为序列表中的SEQ ID N0:7 8的氨基酸残基序列的核苷酸碱基序列。本专利技术的目的是通过以下另一技术方案实现的:导致西瓜两性花发育的基因a序列的获得方法，包括以下步骤:A、供试材料选取:选取供试体材料；B、基因组DNA的提取:将所述的供试材料分别进行DNA提取处理，得到供试材料基因组DNA ；C、长距离PCR扩增反应与产物的检测:以所述的供试材料基因组DNA为模板，进行长距离PCR扩增反应，得到长距离扩增产物；D、特异性扩增序列的获得:将所述的长距离扩增产物进行纯化处理后与质粒载体进行连接反应，得到重组质粒；再将所述的重组质粒转入感受态细胞，再进行筛选、检测、测序，得到特异性扩增序列；E、候选SNP的获得:将所述的特异性扩增序列的核苷酸序列进行分析比对并结合内含子剪切预测结果，得到候选SNP位点； F、对所述的候选SNP位点进行验证，获得所述的导致西瓜两性花发育的基因a序列。本专利技术的有益效果为:本专利技术应用比较基因组学原理，在西瓜深度序列上比对甜瓜CmACS-7基因序列，通过全基因组搜索获得候选基因，并利用长距离PCR技术扩增出候选基因片段并克隆、测序，通过分析其DNA序列和蛋白质序列确定目的基因；大大缩短了定位基因的时间；本专利技术通过F2代分离群体dCAPs分子标记检测及表型鉴定、各核心种质资源dCAPs分子标记检测及表型鉴定确认该SNP位点为共分离标记；获得的SNP位点，能够开发基因标记用于辅助育种，达到获得西瓜雌性系品种的目的。附图说明图1为实施例1的亲本及重测序材料a基因DNA序列比对结果图；图2为实施例1的未本及重测序材料a基因蛋白质序列比对结果图；图3为实施例1的对亲本进行长距离PCR扩增的电泳结果图；图4为实施例1的引物a_FspBI对亲本及西瓜22个重测序材料的扩增并利用FspBI限制性酶切后的结果图；图5为引物a_FspBI对F2群体的扩增并利用FspBI限制性酶切后的结果图。具体实施例方式实施例1:本实施例为。导致西瓜两性花发育的基因a，具有序列表中的SEQ ID NO:1 6的核苷酸碱基序列。导致西瓜两性花发育的基因a，具有翻译为序列表中的SEQ ID N0:7 8的氨基酸残基序列的核苷酸碱基序列。序列表中SEQ ID NO:1为雄花完全花同株材料长距离PCR特异性扩增的序列；序列表中SEQ ID NO: 2为雌雄异花同株材料长距离PCR特异性扩增的序列；序列表中SEQ ID NO:3为雄花完全花同株材料⑶S区的序列；序列表中SEQ ID NO:4为雌雄异花同株材料CDS区的序列；序列表中SEQ ID NO:5为雄花完全花同株材料dCAPs引物特异性扩增的序列；序列表中SEQ ID NO:6为雌雄异花同株材料dCAPs引物特异性扩增的序列。序列表中SEQ ID NO:7为雄花完全花同株材料蛋白质氨基酸残基序列；序列表中SEQ ID NO:8为雌雄异花同株材料蛋白质氨基酸残基序列。该获取方法包括以下步骤:A、供试材料选取:所述的供试体材料包括:父本阿柯克孜外，为典型雌雄完全花同株材料；母本新红宝，为典型的雄花完全同株性型材 料；以二者为亲本进行杂交获取的F1代；该F1代自交获得&代；22个西瓜基因组重测序材料(详见表I) ;519份西瓜种质资源构成的自然群体(详见表2)；B、基因组DNA的提取:将所述的供试材料分别进行DNA提取处理，得到供试材料基因组DNA ；所述的DNA提取处理为参照Murry等(1980)的方法(Murray M, ThompsonW F.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J].Nucl AcidRes, 1980,8:668-673.)的基础上改进而成；具体步骤如下:a.取1.5克叶片，在液氮中研磨成粉末，再加入9ml2%CTAB提取液(2%CTAB，1.4mMNaCl, IOOmM Tris-HCl pH8.0,20mM EDTA ρΗ8.0，1%PVP_40，0.2%β -巯基乙醇)，混匀，于65°C水浴I小时，得到混合物A ;b.将所述的混合物A停止水浴，加入1/3体积的5M的醋酸钾溶液，混匀，冰浴20分钟；再加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)抽提两次，得到上清液A ；c.向所述的上清A中加入2/3体积异丙醇用来沉淀DNA ;再用洗涤缓冲液(76%乙醇，IOmM乙酸铵)洗涤一次，吹干，再加TE缓冲液(IOmM Tris-HCl，ImM EDTA，pH7.4)溶解，得到溶液A ；d.向所述的溶液A中加入RNase A，使其终浓度达100 μ g/ml，再混匀37°C水浴I小时；再用等体积氯仿/异戊醇(24:1)抽提一次，得到上清液B ；e.向所述的取上清液B中加入1/2体积7.5M醋酸铵、2倍体积无水乙醇，得到DNA沉淀；f.用70%乙醇洗涤所述的DNA沉淀，吹干，加适量ddH20溶解DNA，得到供试材料基因组DNA ；再用紫外分光光度本文档来自技高网...
【技术保护点】
导致西瓜两性花发育的基因a，其特征在于：具有序列表中的SEQ?ID?NO:1～6的核苷酸碱基序列。
【技术特征摘要】
1.导致西瓜两性花发育的基因a,其特征在于:具有序列表中的SEQID N0:1 6的核苷酸碱基序列。2.导致西瓜两性花发育的基因a，其特征在于:具有翻译为序列表中的SEQID N0:7 8的氨基酸残基序列的核苷酸碱基序列。3.导致西瓜两性花发育的基因a基因序列的获得方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: A、供试材料选取: 选取供试体材料； B、基因组DNA的提取: 将所述的供试材料分别进行DNA提取处理，得到供试材料基因组DNA ； C、长距离PCR扩增反应与产物的检测: 以所述的供试材料基因组DNA为模板，进行长距离PCR扩增反应，得到长距离扩增产物； D、特异性扩增序列的获得: 将所述的长距离扩增产物进行纯化处理后与质粒载体进行连接反应，得到重组质粒；再将所述的重组质粒转入感受态细胞，再进行筛选、检测、测序，得到特异性扩增序列； E、候选SNP的获得: 将所述的特异性扩增序列的核苷酸序列进行分析比对并结合内含子剪切预测结果，得到候选SNP位点； F、对所述的候选SNP位点进行验证，获得所述的导致西瓜两性花发育的基因a序列。4.根据权利要求3所述的导致西瓜两性花发育的基因a序列的获得方法，其特征在于: 步骤C的长距离PCR扩增反应中， 上游引物的核苷酸序列:5’ -CCAATTTCTATCAAATATGGGCAATG-3’， 下游引物的核苷酸序列:5’ -TCTCTGGATCTTAAAACCCGATT-3’。5.根据权利要求3或4所述的导致西瓜两性花发育的基因a序列的获得方法，其特征在于: 步骤C的长距离PCR扩增反应中，反应程序为: 阶段 1:94°C预变性 5min ;阶段 2 -MV 30s, 55°C 30s, 68°C 2min，共 10 个循环;阶段 3:94°C 30s，55°C 30s，68°C 2min，第一个循环的时间为2分钟，从第二个循环开始，时间在前一个循环的基础上增加5秒，共25个循环；阶段4:68°C延伸IOmin ;阶段5:4°C保存。6.根据权利要求3所述的导致西瓜两性花发育的基因a序列的获得方法，其特征在于:步骤F中的验证中，利用基因标记a_dCAPs进行PCR扩增反应中， 上游引物的核苷酸序列:5’ -CAATAACG...
【专利技术属性】
技术研发人员：许勇，纪高洁，张海英，郭绍贵，任毅，宫国义，张洁，孙宏贺，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，北京京研益农科技发展中心，
类型：发明
国别省市：
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