本发明专利技术涉及半滑舌鳎性别相关基因，其氨基酸序列为SEQ?ID?NO:1；编码上述的性别相关蛋白的核苷酸序列为SEQ?ID?NO:2。本发明专利技术的基因与半滑舌鳎性逆转密切相关，其体外重组蛋白能够明显升高卵泡抑素FST基因的表达水平，并在短期内抑制雌性相关基因P450,Foxl2和CTNNB1的表达，抑制基因的表达可能降低半滑舌鳎性逆转比例，因此，在半滑舌鳎性别控制中具有应用潜力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于水产生物技术中的功能基因筛选与应用
，具体涉及半滑舌鳎性别相关基因CSsrl的克隆、体外重组表达及其表达产物的活性分析。
技术介绍
半滑舌鳎(Cynogloss ii s semilaevis)是一种近海温水性大型底栖鱼类,其肉质鲜美、营养丰富，深受消费者喜爱，是我国海水养殖主导鱼类之一。但半滑舌鳎雌、雄个体生长速度差异很大，雌性比雄性生长快2-4倍。由于雄性个体生长缓慢、个体小等原因，致使增加了半滑舌鳎的养殖成本、降低了养殖产量，严重影响了半滑舌鳎苗种的推广及养殖产业的发展。因而开展半滑舌鳎性别决定关键基因的筛选鉴定及其功能的分析研究是揭示半滑舌鳎性别决定机制、探索雌雄生长差异的分子机理、建立性别控制技术的重要任务。在鱼类性别决定的分子机制的研究中，人们对哺乳动物的许多性别决定的同源基因进行了研究，这为从分 子水平上阐明动物的性别决定和分化机制奠定了基础。但是，很多在其他脊椎动物中与性别决定相关的基因在鱼类中并没有性别的差异，说明鱼类有其特有的性别决定机制。因此，目前人们又逐渐转向寻找鱼类自身性别决定基因的研究上来。例如，在青鏘(Oryzias latipes) Y染色体上的性别决定相关区段发现了一个性别决定基因DMY，该基因是迄今为止在鱼类Y染色体上找到的与精巢发生和分化直接相关证据最充分的I个性别决定功能基因。但后来在一些与青鏘亲缘关系非常相近的物种及其他硬骨鱼类的研究中并未能找到 DMY 的同源基因(Matsuda et al., 2003 ；Volff et al., 2003; Kondoet al.，2003)，而在其它鱼类尚未见有关性别决定基因克隆的成功报道。有关鱼类性别决定相关基因，特别是半滑舌鳎性别决定基因的筛选与克隆以及性别决定分子机制的研究是目前国内外急待攻克的重要科学问题，也是建立半滑舌鳎性别控制和全雌苗种培育技术的重要基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是筛选半滑舌鳎性别决定相关基因，获得性别相关基因的序列，进行体外重组表达，获得重组表达产物，鉴定重组表达产物的生物活性及基因的功能，为半滑舌鳎性别控制和全雌苗种研制提供基因资源和技术方法。本专利技术一个方面涉及半滑舌鳎性别相关基因CSsrl，其氨基酸序列为SEQIDNO:1 ；编码上述的性别相关蛋白CSsrl的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2。本专利技术的另一个方面涉及用于重组表达CSsrl蛋白的重组质粒，本专利技术的半滑舌鳎性别相关蛋白在半滑舌鳎性别控制中的应用。本专利技术的CSsrl基因与半滑舌鳎性逆转密切相关，其体外重组蛋白能够明显升高卵泡抑素FST基因的表达水平，并在短期内抑制雌性相关基因P450，Foxl2和CTNNBl的表达，抑制CSsrl基因的表达可能降低半滑舌鳎性逆转比例，因此，在半滑舌鳎性别控制和提高雌性鱼苗比例方面具有应用潜力。附图说明图1:本专利技术构建的原核表达载体图谱；图2:半滑舌鳎CSsrl重组表达蛋白SDS-PAGE分析；其中A:PET-32-CSsrl诱导不同时期采样SDS电泳图，M:标准分子量marker，1-3:诱导6h，4-5:诱导4h，6-7:诱导2h，8-9:pet-32a诱导6h.B:重组蛋白纯化SDS电泳图，I:纯化重组蛋白，2:标准分子量marker。具体实施例方式下面结合附图实例对本专利技术的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。一、半滑舌鳎性别相关基因CSsrl的克隆及其序列通过半滑舌鳎全基因组测序，转录组和生物信息学分析获得半滑舌鳎性别相关基因CSsrl的部分cDNA序列，然后设计引物从半滑舌鳎精巢中克隆到了性别相关基因CSsrl的全长cDNA，其全长序列为SEQ ID NO:2，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。半滑舌鳎性别相关基因CSsrl的cDNA编码序列为519bp，见SEQ ID N0:2序列。具体步骤如下: 1、半滑舌鳎性别相关基因CSsrl cDNA片段的克隆根据半滑舌鳎基因组测序，转录组测序和生物信息学预测的CSsrl部分序列设计引物 CSsrl-hfl (5 ' -CAGACTGTCTCAGGAGCGCAA-3 ' )、CSsrl-Hrl(5' -GGGCAAACTTCTTGGCCTG-3')，并利用此对引物扩增CSsrl基因片段，验证基因片段的准确性。PCR反应条件按照以下进行:94°C预变性5min，94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸lmin,32个循环；72°C延伸5min。2、半滑舌鳎性别相关基因CSsrl的序列采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术，根据上述CSsrl基因片段设计PCR引物(CSsrl-5, GSP:5' -CACTGTGCCTGACGGATAGACATTTGGGT-3' , CSsrl-3' GSP:5' -AGGAACCTTATGGGAGGGAGGGCTTTACA-3 ')，从半滑舌鳎精巢中克隆到了别相关基因CSsrl的全长cDNA，其全长序列为SEQ ID NO:2，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID N0:1。cDNA序列获得采取cDNA末端扩增(RACE)，方法按照SMARTer RACE cDNAAmplification Kit (Clontech),其具体操作条件如下:RACE所用的体系以及反应条件:50 U I反应体系5 U I IOX BD Advantage 2 PCR BufferI u I dNTP Mix(IOmM)5u I u PMI u I GSP2 ii I 3，-RACE-Ready cDNAIul 50X BD Advantage 2 Polymerase Mix35 u I PCR-grade water反应条件如下:94 °C 30S,72°C 3min5 个循环，94 °C 30S, 70 °C 30S, 72 °C 3min5 个循环，94 °C30S, 68 °C 30S, 72 °C 3min27 个循环5' RACE所用体系及反应条件:50 u I反应体系5 U I IOX BD Advantage 2 PCR BufferI u I dNTP Mix(IOmM)5u I u PMI u I GSP2 ill 5' -RACE-Ready cDNAIu 150X BD Advantage 2 Polymerase Mix35 u I PCR-grade water反应条件如下:94 °C 30S,72°C 3min5 个循环，94 °C 30S, 70 °C 30S, 72 °C 3min5 个循环，94 °C30S, 68°C 30S, 72°C 3min27 个循环。将3' RACE和5' RACE的PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，用胶回收试剂盒(Tiangen gel extraction kit)进行PCR产物的回收和纯化,再与pMD_18T载体(Takara)连接后转化至大肠杆菌T0P10感受态细胞，挑选阳性克隆提取质粒测序，测得的序列经Vec本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种半滑舌鳎性别相关蛋白，其氨基酸序列为SEQ?ID?NO:1。
【技术特征摘要】
1.一种半滑舌鳎性别相关蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。2.—种半滑舌鳎性别相关蛋白的基因，所述的基因用于编码权利要求1所述的半滑舌鳎性别相关蛋白。3.如权利要求2所...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡乔木，黄倢，严芳，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：
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